彗星试验方法.doc

主要仪器数显电热恒温水浴箱、电泳仪、电子分析天平、荧光显微镜及数码成像系统、匀浆器、磁力搅拌器。主要试剂氯化镉（CdCl22.5H2O），分析纯，上海亭新化工试剂厂，批号20080901。使用时用去离子水配制成不同浓度。正常熔点琼脂糖（NMA），低熔点琼脂糖（LMA），N-十二烷基肌氨酸钠，Triton-X-100，溴化乙锭（EB）。氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA），三（羟甲基）胺基甲烷（Tris），氢氧化钠（NaOH），二甲基亚砜（DMSO），盐酸（HCl）等，均为国产分析纯试剂。主要溶液的配制磷酸缓冲液（PBS） NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4.12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，无Ca2+、Mg2+双蒸水1000ml，调pH至7.4，冰箱4保存备用。0.5%正常熔点琼脂糖（NMA） 0.5g NMA与100ml磷酸缓冲液混合，加热溶解，冷却后冰箱4保存备用。0.5%低熔点琼脂糖（LMA） 0.5g LMA与100ml磷酸缓冲液混合，加热溶解，冷却后冰箱4 保存备用。细胞裂解液 精确称取NaCl 146.1g，Na2EDTA 37.2 g ，N-十二烷基肌氨酸钠10 g，Tris 1.22 g，放入1000 ml烧杯中，加800ml双蒸水，磁力搅拌溶解（可加热），以4 mol/L NaOH调pH到10.0，在容量瓶中加水定容到1000 ml。冰箱4保存备用。临用前根据用量按总体积加1% Triton-X-100，10% DMSO混匀。碱性电泳缓冲液 Na2EDTA 0.186g，NaOH 6g，加500ml双蒸水定容，pH13，现配现用。 Tris-HCl中和液 称取Tris 48.44g，加600ml双蒸水溶解，用浓盐酸（约13.5ml）调pH值至7.5，加水定容到1000ml，4保存备用。EB染色液（0.03mg/ml） 溴化乙锭（EB）3.0mg，双蒸水100ml，避光4保存备用。试验分组染毒单细胞凝胶电泳试验在染毒第40 d时，各组小鼠摘眼球取血后打开胸腔，左心室插管，右心耳打一切口，生理盐水快速灌流至动物尸体展开，肢体变硬为止。迅速取肺脏组织，用冰冷的PBS漂洗三次至无血，再用不锈钢剪刀将其剪碎，加适量PBS液到玻璃匀浆器研磨，并过300目不锈钢筛网，得单细胞悬液。然后以5000r/min离心5min，轻轻吸去上层溶液，再加PBS，冲洗1次，离心后将细胞浓度调整为106107个/ml，台盼兰染色镜检细胞存活率（细胞存活率90%以上），立即进行以下步骤。（1）胶板的制备 第一层胶的制备：将已预热56的80l 0.5%正常熔点琼脂糖NMA（溶于无Ca2+，Mg2+的磷酸缓冲液PBS）滴到同样预热的载玻片的磨砂面，迅速盖上干净的盖玻片，4放置10min使其凝固。 第二层胶的制备：取10l含1000个细胞的PBS和75l 0.5%低熔点琼脂糖LMA（溶于无Ca2+，Mg2+的磷酸缓冲液PBS）在37混匀，然后轻轻揭去盖玻片，将含细胞的LMA滴到第一层胶板上，立即盖上干净的盖玻片，4 放置10min使其凝固。 第三层胶的制备：最后在凝固的LMA层上滴加85l预热37 的0.5% LMA，盖上盖玻片，使其凝固。第一层胶的主要目的是使第二层平整和附着紧密，第三层胶的目的是对第二层细胞起保护作用。（2）细胞裂解 移去盖玻片，将载玻片浸入新配置的细胞裂解液中至少裂解1h（在放第一片开始计时，再以同样的顺序取出，确保每张片子裂解时间相同）。此步骤的目的是溶解细胞膜及核膜，除去蛋白质、RNA等，仅存留核骨架。（3）DNA碱解旋 细胞裂解后，取出载玻片，用PBS冲洗2次，以去掉载玻片表面高浓度的盐，然后将载玻片置于水平电泳槽中，倒入新配置的碱性电泳缓冲液，约覆过胶面0.25cm。碱解旋20min，以便使DNA在碱性条件下解螺旋形成单链DNA，使DNA断链，在电泳场中易于迁移。（4）单细胞电泳 在25v、300mA条件下电泳20min。（5）中和与染色 电泳完毕后，将载玻片取出，滤纸吸干电泳缓冲液，用Tris-HCl（pH7.5）中和15min。然后每片载玻片上滴加50l 30g/mL的溴化乙锭（EB）溶液，避光操作，盖上盖玻片，避光染色20min，即可观察。（6）试验结果观察与数据处理 EB染色后的样本尽快在荧光显微镜下观察并拍照电泳图谱。 每只小鼠的肺组织制一张片子，每张片子随机选择100个肺细胞，计数各组小鼠肺组织的拖尾细胞数，计算拖尾率，并利用统计软件SPSS 10.0进行X2 检验。 每只小鼠的每张肺组织片子随机选择25 个细胞，利用Comet Assay Software Pect (CASP 1.2.3 beta 1) 图像分析软件 (/index.php) 对彗星图像进行指标分析，用 SE表示彗星全长( CL) 、尾长( T L) 、尾矩( TM) 和Olive 尾距( OTM)，并利用统计软件SPSS 10.0分析，显著性比较采用t 检验。 根据拖尾细胞中，彗星尾部DNA含量 ( TDNA%)，将细胞DNA 损伤程度分为5级。 0 级： 无损伤( 正常细胞) 及细胞损伤率 95%。细胞图像仅有很少的头部或无头部, 有很长很大的尾部，根据文献 13 细胞不用于基因毒性分析。正常和低熔点的凝胶可以买到，不贵，提前称好，用前用PBS溶解，煮沸，就可以用了。如果每个动物观察细胞数为50-100个的话，首先计算出每一只动物各个指标的平均数，然后再拿这5只动物平均数的平均数进行分析，而不是100（细胞数乘以5（动物数）=500各细胞的平均数。这样可以分辨出同一剂量组之间的个体差异，还可以分析不同剂量之间的显著差异性。彗星试验常用的阳性对照：ethyl methanesulfonate(EMS)，ethyl nitrosourea (ENU)，methyl methanesulfonate (MMS)，N-nitrosodimethylamine (N-DMA)和1-nitros