单细胞凝胶电泳检测技术.doc

单细胞凝胶电泳检测技术摘要： 单细胞凝胶电泳技术又称彗星实验，是一种在单细胞水平上检测DNA损伤与修复的方法，具有快速、简便、价廉的优点。近年来越来越多的应用于遗传毒理学、生物和环境检测、肿瘤学的研究，本文就这些方面进行了综述。关键词： 单细胞 电泳 DNA损伤与修复单细胞凝胶电泳（single cell electrophoresis assay, SCGE）又称彗星试验（comet assay）,是一种在单细胞水平上检测DNA损伤与修复的方法，由Ostling等于1984年首次提出，并利用该技术在中性条件下检测射线引起的DNA双链断裂。1988年Singh等建立了碱性单细胞凝胶电泳技术。1997年，Santos等首次将SCGE技术与DNA荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)结合起来，为SCGE技术的应用开辟了新的途径。2001年， Nadin等建立了SCGE银染法，进一步提高了损伤DNA分析的灵敏度1。1 SCGE 技术原理及方法11 原理 在中性条件下，DNA双链不打开，只有DNA双链断裂时，才有DNA断片进入凝胶中迁移；在强碱条件下，DNA双链被打开，释放出断裂的DNA片段，电泳时，带负电荷的DNA移向正极，形成“彗星”状影像，DNA损伤越多，进入尾部的DNA碎片越多。尾长在辐射高剂量时达到饱和不再增加，而尾矩则与辐射量呈线性相关。因此，在尾长、密度、面积、尾矩等各项分析指标中，尾矩能更精确地测定DNA损伤。212 实验方法 首先制备细胞悬液，并用PBS调整细胞浓度为106107个/ml，细胞溶解后再进行DNA损伤的诱导处理。121 制片 有3种类型: (1) “三明治”凝胶,第1层为100110l 10.5%的NMA,第2层为合细胞悬液的LMP75l,第3层仍为LMP75l。 (2)双层凝胶,即不铺第3层胶; (3)单层凝胶,为改善其易与玻片分离的特点,可在玻片上制一凹槽进行单层灌胶3。经实验发现，一层胶法的效果不好，胶太薄容易漂浮；三层胶虽然解决了脱落漂浮的问题，但会影响观察的效果；而二层胶法既能使胶面较好的附着，又能使细胞尽可能多的处于同一平面，染色效果更好4122 细胞裂解 目的是去除细胞浆，只留核中的DNA，裂解时间多为1小时。为了避免脱胶，裂解液在使用前需预冷，同时裂解液中要加入1%DMSO为减少裂解中自由基对DNA的额外损伤。在有的实验中还需要加入蛋白酶K，以清除蛋白质残基，避免DNA修复酶的作用5123 解旋 裂解后在碱性溶液（1 m mol/L Na2EDTA,300 m mol/L NAOH p H13）中使DNA双链打开，时间约为2060分钟。124 电泳 一般在低电压（0.55V/cm）和短时间（2030min）内进行。电压过高或电泳时间过长，彗星细胞拖尾以致彗星消失，而非彗星细胞也会泳出尾部形成假阳性结果；反之，电压过低或时间过短，DNA断片不易泳出，受损细胞无拖尾而造成假阴性结果5125 阅片 在玻片上滴加溴乙锭、DAPI（根据实验的不同，采用不同的浓度）等，加盖盖玻片，即可在荧光显微镜下观察。 上述过程均应在黄光或暗室中操作，避免引起额外的DNA损伤。126 实验结果分析 在荧光显微镜下放大200倍或400倍进行图象观察，观察指标有尾长即DNA迁移的长度，在低损伤剂量范围内与DNA损伤呈线性关系；尾矩即尾长与尾部DNA百分含量之乘积，在高损伤剂量下与损伤程度呈线性关系；尾惯量是与每个尾块的面积、平均荧光强度、在X轴上与彗星中心距离有关的综合性指标。彗星图象分析方法有：目镜测微尺直接测量，显微照相后用两脚规测量，经图象分析仪进行分析，或借助专门的图象分析软件如Lucia、Auto Gentox等彗星图象分析软件进行分析62 SCGE研究的类型 用于SCGE的生物种类很多，哺乳类有人、大鼠、小鼠、兔等；非哺乳类有鲫鱼、泥鳅、蚯蚓等。植物类的烟草；谷康定等还将此技术应用到真核单细胞微生物（四膜虫），且认为从方法上完全可以与动物原代和传代细胞互相替代7。细胞类型主要包括外周血淋巴细胞、肝细胞、脾细胞、胸腺细胞、骨髓细胞、肺泡细胞、鼻黏膜细胞、肿瘤细胞、睾丸细胞、神经细胞、精子及培养细胞、植物细胞等8。 用于SCAG的研究因子大致可分为3类，物理因素包括各种放射性元素、射线、冰冻、光照等；化学因素包括重金属及其化合物、过氧化物、臭氧、石棉、有机致癌物、有机染料、麻醉剂、抗癌药物、抗真菌剂等；生物因素包括细胞类型、细胞生长周期、细胞的DNA修复能力及年龄、生活习惯（如吸烟）等影响因素。3 应用随着现代生物学和医学的发展，SCGE在许多方面得到了越来越多的应用。31 在遗传毒理学中的应用：SCAG是一种评价遗传毒理损伤非常敏感的方法，可在体内、体外对细胞进行DNA损伤诱导，以探讨已知遗传毒物和诱变剂的特异活性，包括体外细胞特异代谢和DNA修复，体内相关途径给予化合物的代谢动力学和剂量反应的关系，以及某些化合物的遗传毒性等，而有些环境中的一些毒物常常是组织特异性或细胞特异性的。致突变效应、致癌效应是遗传毒性的长期效应，突变的程度和类型又与DNA链损伤修复的情况相关。SCGE能检测出各种理化因素所致的DNA链断裂、DNA切除修复、氧化损伤及DNA交联9。Sardas等对吸入性麻醉药isofiurane进行分析发现，麻醉后1h ,彗星平均尾矩明显增加，2h后达到高峰，1d后下降，5d后则恢复正常，实验显示该药物具有遗传毒性，遗传损伤可以修复，但着色性干皮病人则损伤修复不完全。进行体内实验的SCGE分析可减少假阴性结果，并提供各组织、器官、细胞中的DNA损伤和修复的信息，推测组织和细胞特异性。对于有争议的化合物，用SCGE检测DNA，可以评价该化合物在某剂量下是否具有遗传毒性。32 DNA损伤与修复的检测：SCGE不只是反映DNA链断裂，也包括酶介导的损伤和修复。用UV-射线照射T淋巴细胞，发现T淋巴细胞的损伤和修复与DNA链的再聚合有关2。损伤后的切除修复是通过细胞核酸内切酶来完成的。SCGE可进行从损伤到修复、合成、连接的单步骤各时间点观察；马爱国等曾报道不同种类细胞DNA氧化损伤及自我修复能力有不同，增殖率较高的细胞（如Hela细胞）对H2O2的作用比非增殖细胞（如淋巴细胞）较敏感，其修复速度Hela细胞也明显大于淋巴细胞10。同时也用于对一些外来因素，如蛋白、抑制剂、脱氧核苷酸等对细胞DNA损伤与修复的研究，并用于修复缺陷型细胞DNA损伤与修复的研究11。33 生物检测和流行病学研究：DNA链断裂作为鱼和其他水生生物遗传毒性的生物标志物可以通过SCGE检测。体内、体外试验都表明，化学毒物确实影响了一系列脊椎和非脊椎水生生物的细胞类型。胡晓磐等研究了氯化镉对鲫鱼淋巴细胞DNA的损伤，随着镉剂量的增加，DNA的损伤加重12。同时诱发鱼类细胞染色体畸变，导致红细胞核异常及不同组织中蛋白质发生质和量的变化。SCGE还可用于有害物存在的场所中各类人群DNA损伤的检测。在对长期接触高浓度苯的工人，苯暴露水平为3 mg/m3加油站服务人员以及接触高温、CO工人的外周血淋巴细胞检测后，发现其淋巴细胞DNA损伤都有显著提高2。吸烟者戒烟后彗星尾长显著降低。在人群检测中应考虑年龄、性别、吸烟、饮酒等多种因素的影响，因此在采样时，对照与暴露个体都应处在相同的生理阶段。34 在肿瘤学中的应用：SCGE能够检测单个细胞DNA的损伤，能够用来评价细胞的损伤与修复能力，可以用于探讨肿瘤的病因、发生、发病机制。肿瘤细胞和正常细胞对理化治疗所致DNA损伤与修复能力将决定治疗方案的对与否，如果肿瘤细胞有高于正常细胞的修复能力，则意味着增大了治疗的危险性，治疗必将失败。在癌细胞中有一种缺氧细胞，它的DNA断裂比有氧细胞低，用SCGE分析可估量缺氧细胞数，进一步识别与检查癌细胞对抗癌剂的反应，主要用于接受化疗的肿瘤细胞，有助于评估肿瘤对放、化疗反应的不同，预测治疗方案的效果。Olive PL等用SCGE验证尼克酰胺可以减少肿瘤的缺氧细胞，从而增加肿瘤细胞对射线的敏感性，同时显示该药可更多地阻止肿瘤细胞修复而达到抗癌目的。Rao用SCGE对口腔上皮细胞鳞癌患者外周血淋巴细胞检测，结果显示在不同的临床期细胞DNA电泳结果明显不同，和临床期对比存在统计学差异8。35 在环境检测中的应用：用SCGE检测DNA断裂在环境监测中的应用范围极其广泛，在某种程度上可以将它作为环境污染物对健康的早期评价指标。苑宇哲等以蝌蚪为指示生物，利用SCGE检测DNA断裂，来判断水体是否污染13。国外以这种方法检测水体污染进行较早，也比较规范，已经建立了比较科学、实用、规范的检测体系。1998年，Steven等就运用这种体系检测了美国南部10个水体的污染程度；泥鳅红细胞的SCGE检测方法的建立也有助于揭示不同污染物对水生生物的危害及作用本质，特别是将它与红细胞微核试验的结果综合起来进行分析，对于水环境质量的评价将具有重要意义4。1998年，Gichner等将SCGE技术用于植物细胞，建立起了新的环境检测系统。另外，SCGE在研究大气污染物、重金属、醛类、辐射等环境污染方面也是一种较理想的检测技术14。36 其它：SCGE也可用于细胞凋亡、免疫学、氧化损伤以及临床病因学、诊断学等领域。刘强等更是首次该技术用于辐射生物剂量计，通过研究全身照射和离体照射致DNA双链断裂的一致性，明确了SCGE作为辐射生物剂量计的可行性15。在实际应用中应考虑年龄、细胞类型、细胞生长周期等对实验结果的影响。要注意的是，在碱性条件下，单细胞电泳出现的泳带可能是DNA断裂的结果，也可能是亲碱性区域的结果。采用精子标本时应特别注意这种情况16。4 结语 SCGE能敏感检测单细胞水平的DNA断裂，具有快速、简便、价廉等优点，广泛应用于遗传毒理学、生物检测、肿瘤学等多个领域的研究。但在实验中还有一些问题尚待改进和解决，如“彗星”形成原理、电泳条件的探索、玻片制备方法的改进、图象分析软件的发展等。随着实验方法的不断改进，这些问题都将得到解决，SCGE在个领域的应用将进一步拓宽。参 考 文 献1 田云 卢向阳等. 单细胞凝胶电泳技术. 生命的化学, 2004 , 24(1) : 77782 邢彩虹 单细胞凝胶电泳技术的进展及应用. 中华劳动卫生职业病杂志, 1999 , 17(6): 3703723 张正东 刘丰 单细胞凝胶电泳技术操作方法的改进 . 南京医科大学学报, 1999 , 19(4):3263274 吴若菁 林霞 泥鳅红细胞单细胞电泳技术的研究 . 水产科学, 2006, 25(2):82845 王晓平等. 单细胞凝胶电泳在检测甲醛遗传毒性研究中的应用. 玉林师范学院学报(自然科学) , 2005, 26(5):66696 李彦 谢明 单细胞凝胶技术操作方法介绍 . 生物学通报 , 2005 , 40(7):52537 谷康定等 单细胞凝胶电泳在真核微生物上的应用 , 华中科技大学学报 , 2004 , 33(2):139 1428 宋博 郑履康 单细胞凝胶电泳技术的应用与进展 . 中国职业医学, 2000 , 27(6):45479 杨建一 彭芸 李莉 单细胞凝胶电泳检测单细胞DNA损伤 . 山西医药杂志, 2002 , 31(5):400 40210 马爱国 Andrew RC Susan JD 不同细胞DNA氧化损伤及自身修复能力的分析 . 癌变畸变突变, 1997 , 9(3):13814211 韩宗超 张苏明 单细胞凝胶电泳在DNA损伤与修复检测中的应用 . 中华检验医学杂志 , 2000 , 23(3):18018212 胡晓磐 周建华 时夕金 利用单细胞凝胶电泳技术研究镉对鲫鱼淋巴细胞DNA的损伤 . 农业环境科学学报 , 2005 , 24(1):43