猪肝金属硫蛋白的提取方法.doc

猪肝金属硫蛋白的提取方法发布时间： 2009年12月31日 发布人： 路简随风 金属硫蛋白（简称MT）。从1978年到1999年先后在瑞士、日本、美国共举行了四次国际专题研讨会，第五次国际专题研讨会于2005年10月在北京召开。 是国家自然基金资助项目,1995年联合国已将MT列入向世界各国推荐的生物技术产品。由此可见从国内到国外对金属硫蛋白的研究、开发、推广、应用的高度重视。一 国家对生物技术的重视。金属硫蛋白（简称MT）。从1978年到1999年先后在瑞士、日本、美国共举行了四次国际专题研讨会，第五次国际专题研讨会于2005年10月在北京召开。 是国家自然基金资助项目,1995年联合国已将MT列入向世界各国推荐的生物技术产品。由此可见从国内到国外对金属硫蛋白的研究、开发、推广、应用的高度重视。二 简介：金属硫蛋白（简称MT）该研究针对我国畜牧业持续发展和畜产品生产中存在的效率低、质量安全性差、资源浪费严重等关键问题，研究金属硫蛋白、小肽、氨基酸螯合物和半胱胺等生物活性物质在动物体内的消化、吸收、运转、分布和排泄规律，继而研制和开发优质环保型饲料及其添加剂，并在生产实践中推广应用，对促进畜牧业资源的合理配置和高效利用、提高畜产品的品质和安全性、确保畜牧业可持续发展具有重大意义。该项目在我国率先采用同位素技术和分子生物学方法研究金属硫蛋白（MT）对肉质生理生化指标的影响以及半胱胺对猪生产性能、胴体品质、血液激素水平等影响；率先螯合出同位素标记的氨基酸金属螯合物65ZnMet；同时还创建了高精度定量检测动物体内MT的间接非竞争型ELISA法和多种氨基酸金属螯合物的螯合新工艺。已经产生了显著的学术影响。在深入系统研究三类生物活性物质对畜体营养功能的基础上，研发了利用生物活性物质对畜牧业和畜产品的高效、安全生产进行调控的配套技术。专家一致认为，该项目技术成果整体上居同类研究的国际先进水平，其中用同位素技术研究金属硫蛋白和氨基酸金属螯合物在动物体内的代谢、存留分布；用分子生物学方法研究金属硫蛋白拮抗猪体内氧自由基机理；用血管、瘘管技术研究小肽对山羊门静脉血糖、血氨和血浆氨基酸的影响以及猪肝金属硫蛋白的诱导提取等研究居国际领先水平。三金属硫蛋白的用途：金属硫蛋白MT的重要生理功能表现在它是一种目前为人们所知的最有效的自由基清除剂，其清除羟自由基(?OH)的能力约为SOD的几千倍，而清除氧自由基(?O)的能力约是谷胱甘肽(CSH)的25倍，并且具有很强的抗氧化活性。自由基是一种人体内的垃圾，在癌症的发生、发展中起重要的作用；自由基造成的脂质过氧化损伤是肾病发生的重要原因；炎症、衰老、肿瘤、皮肤老化、皮肤紫外线辐射损伤等均与体内自由基增加和MT不能满足需要密切相关；补充MT，可有效的清除体内自由基，起到抑制癌症发生、防治肾并消除炎症和治疗胃溃疡、保护皮肤娇嫩、加强脑中MAO-B的活性，从而延缓衰老等作用。在人体受到有毒金属离子侵害时，肝脏立即分泌大量的MT，通过血液进入全身，与锌、铜、银、汞、镉等金属离子结合，消除它们对细胞的毒害作用，但当人体衰弱或衰老、肝脏分泌MT的能力下降时，补充MT，可以减轻肝脏的负担，清除更多的有毒物质，保护健康，延年益寿。金属硫蛋白是一类富含半胱氨酸和金属的低分子蛋白质。由于它大量的结合多种金属离子，具有特种的生理功能，为生物化学领域所重视。研究和实验表明，MT在以下诸方面发挥作用：调节微量元素的代谢和平衡；有效消除自由基；对重金属解毒；参与细胞DNA的复制和转录；增强肌体对各种应急的反应，增强淋巴细胞的自然杀活性；锌元素的贮存库；防止细胞癌变等作用。因此，金属硫蛋白MT可应用于包括医药、食品保健及化妆品添加剂、基因工程试剂、化学、环保、动物、农业等实验用品等等，前景十分广阔。四 市场状况根据MT在化妆品、保健品和新医药等三个领域的应用发展情况，结合我国消费者的实际水平，以及新医药发展的步骤和速度，化妆品行业年需求20左右，婴幼儿食品添加年需求10左右，中老年保健食品年需求10-20，新医药年需求20左右，而产量为：2003年为6.8公斤，2004年为8.6公斤，2005年为9.5公斤，远远不能满足实际需求。2005年国内市场价：化妆品、保健品用300万元/，医药用800-1000万元/。2005年国外最新报价为82.50美元/毫克，273.7美元/5毫克（商品号M7641）。我国现有1.2亿老年人和3.4亿儿童，全球范围内则更多，仅就老年儿童保健品，女性化妆品和生物药品来看，金属硫蛋白的市场前景非常广阔，每一个方面的应用在全球范围内都有上千亿美元市场空间，单国内就有数百亿元的市场潜力，所以其将来的市场潜力巨大。该专利利用乳猪作为供体，经微量元素腹腔注射诱导、宰杀，从猪的肝脏中分离提取一种具有稳定性好、纯度高的金属硫蛋白，产量是从兔体提取金属硫蛋白的23倍。经诱导的金属硫蛋白具有成本低、效果好、产量高、诱导剂来源广、无副作用等优点。经诱导提取金属硫蛋白后，猪肉可照常供食用，且能带动养殖业的发展，促进农业粮食的转化，增加农民收入，带动农村经济的发展。目前国内采用的都是用兔肝生产金属硫蛋白，设备投入大，转让费高，而且产量低，中国科学院专家经过几年的努力研制出用猪肝生产金属硫蛋白技术，设备投资300多万元，厂房700，投资是用兔肝生产投入的三分之一，而产量却是用兔肝生产的2倍，成本低，效益高。五生产用设备及技术要求（一）生产设备组织捣碎机1台，国产约300元有机变性罐1个200L带搅拌 国产约3万元加热变性罐1个200L带搅拌，有加冷水夹层冷却使用 国产约3万元大容量低温连续离心机4台杯式，每次可离心3L，转速大于8000/分钟，可连续工作12小时以上，国产每台约1.5万元超低温冰箱 -861台 储存成品用进口约10万元纯水生产线1套日产纯水24吨 国产约20万元冻库1个储存猪肝用，10m3 ，-20国产组装约10万元超滤机1台，一次处理100L，配3000分子量膜包，进口（Pool）约20万元小超滤机1台，处理10L溶液，配3000分子量膜包，进口（pool）约10万元层析系统1套，装填料20L（80mm1200mm） 带蠕动泵，进口约20万元离子交换层析系统1套，装填料500ml（35mm200mm），配实验室用蠕动泵，国产组装或进口约1万元程序升温真空冷冻干燥机组一台，一次可冻干2L溶液，上海或天津产约20万元洁净分装台1个，达到10000级洁净级别提取区域洁净安装费用 100150万元装试剂用普通冰箱1台约0.25万元填充介质：进口凝胶Sephardex G-50 2500g （溶胀比例为1：10）约15万元进口离子交换介质 DEAE Spharose F.F 1000ml约2万元（二）检测设备紫外分光光度计（200nm800nm），国产约5万元低容量低温离心机（转速大于10000转/分钟，每次容量达到1000ml），国产约1万元原子吸收分光光度仪进口约40万元，（用于检测锌、铅、铜离子等微量元素可暂缓）蛋白电泳仪，国产约1万元带电磁搅拌机，约0.08万元匀浆机，约0.02万元超纯水生产机（约1万元）或双蒸水生产机约0.1万元其他常用实验设施设备，2万元左右。合计：280320万元六MT生产工艺路线：小猪 隔日梯度诱导5次 宰杀取肝 经诱导后猪肝 捣碎、加有机溶剂 离心搅拌、有机变性 有机变性液 加热变性 离心迅速冷却至室温 热变性液 超滤浓缩 浓缩液 G-50层析 巯基试剂法监测收集溶液洗脱 MT洗脱液 超滤浓缩 真空冷冻干燥 MT冻干粉（含量65%） 浓缩液 离子交换层析 MT洗脱液冻干MT精品（95%）（整个提取生产周期约56小时）七生产场地技术要求：1、远离污染源，通风好，周围绿化环境保护好，无露天泥地。2、供水、供电符合工业生产要求；有专门变电站，可以供送500千伏安以上功率电量。3、配有专门废液、废渣处理池。4、屠宰场地配有表面清洗消毒设施，附近应有冷冻用冰箱或冻库。5、屠宰区域与取肝室分开，中间应有清洗消毒处理间，并取肝室能达到30万级洁净级别。6、提取工艺生产场地应达到10万级洁净级别并配有相应功能区域。7、提取生产区应配有纯水生产车间，日产纯水达到20吨以上，并配有专门成品冷冻储存间、猪肝冷冻储存间及物料间。8、提取功能区域分为：提取操作室、超滤室、层析室、冻干室及操作间、离心操作室等区域。9、有专门的诱导场地，周围应有消毒设施，无躁声等污染。八、经济效益分析按年产5KgMT粗品计算：年生产100批。每批50g，每次需屠宰经5次诱导后小猪100头，取猪肝22.5Kg，捣碎后加入有机变性试剂67.5L 离心后得变性液67.5L，加热变性 ，离心后得热变性液约67L，超滤后得浓缩液约2.5L，分两次进行凝胶层析，定性检测共收集洗脱液约5L，超滤浓缩直接冻干得含量大于65%的MT冻干粉约50g。年产6070%粗品5公斤，按3000元/g销售价计算，产值1500万元，扣除消耗成本（按1500元/g计算）750万元，可得年利税750万元。如提纯含量90%的3.5万元/克，即每公斤3500万元，可提取2公斤，产值7