生理指标测定.doc

实验一 植物叶绿素含量的测定（分光光度法） (生理生化，1996,p103)一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即ACL式中：比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。高等植物中叶绿素有两种：叶绿素a 和b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。叶绿素a和叶绿素b的比值反映植物对光能利用效率的大小，比值高则大，比值小则反之。二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。 （二）仪器设备：1）分光光度计；2）电子顶载天平（感量0.01g）；3）研钵；4）棕色容量瓶； 5）小漏斗；6）定量滤纸；7）吸水纸； 8）擦境纸；9）滴管。（三）试剂：1）95%乙醇（或80%丙酮）；2）石英砂；3）碳酸钙粉。 三、实验步骤 （1）取新鲜植物叶片（或其它绿色组织），擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。 （2）称取剪碎的新鲜样品 0.2g ，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及23ml 95%乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置35min。 （3）取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 （4）用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。 （5）把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长663nm和645nm下测定吸光度。 四、实验结果计算 叶绿素a的含量 = 12.7OD663- 2.69OD645 叶绿素b的含量 = 22.9OD645- 4.86OD663 叶绿素a、b的总含量 = 8.02OD663+ 20.20OD645 注意：1.叶绿素一定要提干净，避免造成测定误差2.叶绿素初提液体积不要太多，以免浪费试剂，如果浓度太高可进行适当稀释实验二 不良环境对植物细胞膜的伤害一、原理植物组织在受到各种不利的环境条件（如干旱、低温、高温、盐渍和大气污染）危害时，细胞膜的结构和功能首先受到伤害，细胞膜透性增大。若将受伤害的组织浸入无离子水中，其外渗液中电解质的含量比正常组织外渗液中含量增加，组织受伤害越严重，电解质含量增加越多。用电导仪测定外渗液电导率的变化，可反映出质膜受伤害的程度。在电解质外渗透的同时，细胞内可溶性有机物也随之渗出，引起外渗液可溶性糖、氨基酸、核苷酸等含量增加，氨基酸和核苷酸对紫外光有吸收，对紫外分光光度计测定受伤害组织外渗液消光值，同样可反映出质膜受伤害的程度。用电导仪法和紫外法测定结果有很好的一致性。二、材料与仪器设备1、仪器设备DDS11A型电导仪法 三、方法步骤1、清洗器具：由于电导仪变化非常灵敏，稍有杂质即产生很大误差。因此所用玻璃器具均需先用热肥皂水洗，再用洗液洗涤，然后用自来水、无离子水各冲四到五遍（最好是容器口朝下用水冲）。向洗净的试管中加入去离子水，用电导仪测定电导值，检查试管是否确实冼净。2、取样及处理 采用电导法(张宪政，1992)：将选取的幼嫩叶片和成熟叶片剪下，包在密封袋内置于冰盒中，带回实验室。将新鲜的叶样先用自来水轻轻冲洗叶片，除去表面沾污物，再用去离子水冲洗12次，用滤纸轻轻吸干叶片表面水分，称0.1 g并剪成切段，放入50 mL带塞试管中，加入20 mL 去离子H2O，浸没样品45 h，各处理浸泡时间和测定温度一致，在室温下进行，用DDs11型电导仪测其电导率，然后沸水浴15 min，冷却至室温再测一次总电导率值。以相对电导率表示细胞质膜透性大小。四、计算：（1）以细胞膜相对透性大小表示细胞受害的程度。通常按下式计算： 细胞膜相对透性（%）= L1/L2100式中：L1：组织杀死前外渗液的电导值；L2组织杀死后外渗液的电导值。、实验三 植物体内游离脯氨酸含量的测定一、目的在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。二、原理磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。三、材料、仪器及试剂1. 材料：植物叶片。2. 仪器：分光光度计；电子分析天平；离心机；小烧杯；普通试管；移液管；注射器；恒温水浴锅；漏斗；漏斗架；滤纸；剪刀；洗耳球。3 .试剂及配制：2.5酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6molL1磷酸中，搅拌加热（70）溶解，贮于4冰箱中,2-3日有效。3磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。10gml-1脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100gml1脯氨酸母液），再吸取该溶液10ml, 加蒸馏水稀释定容至100ml, 即为10gml-1脯氨酸标准液。100gml1脯氨酸母液:称10mg脯氨酸溶于少量的乙醇中，用蒸馏水定容至100ml冰醋酸；甲苯。四、实验步骤1、脯氨酸标准曲线的制作1.1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为012g的脯氨酸标准液。加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。取出冷却，各试管再加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。试 剂管 号01234510gml-1脯氨酸标准液（ml）蒸馏水（ml）冰醋酸（ml）2.5酸性茚三酮（ml）02240.21.8240.41.6240.61.4240.81.2241.01.024每管脯氨酸含量（g）02468101.2用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。1.3标准曲线的绘制以15号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。2.样品的测定2.1脯氨酸的提取称取不同处理的植物叶片各0.5g，分别置大试管中，然后向各管分别加入5ml 3的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。2.2测定吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸、2ml H2O、4ml 2.5酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000r/min离心5min。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。五、计算结果从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：X提取液总量（ml）脯氨酸含量（gg1Fw） 样品鲜重（g） 测定时提取液用量（ml）公式中：X 从标准曲线中查得的脯氨酸含量（g）六、注意事项:1.配置的酸性茚三酮溶液仅在24 h内稳定，因此最好现用现配。2.测定样品若进行过渗透胁迫处理，结果会更显著。3.试剂添加次序不能出错。实验四 植物体内丙二醛含量的测定一、目的通过实验，掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。二、原理丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5三甲基恶唑2、4二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100300gg1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3的终浓度为0.5nmol L1。在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。三、材料、仪器设备及试剂1. 材料：植物叶片。2. 仪器设备：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管（1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。3. 试剂：10三氯乙酸；0.6硫代巴比妥酸（TBA）溶液：石英砂。四、实验步骤（1）提取采用硫代巴比妥酸显色法（赵世杰等，2002）。取叶片，洗净擦干后去中脉。称取0.5 g样品，加5%三氯乙酸2 mL和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml 三氯乙酸进一步研磨，匀浆后4000 rpm，离心10min。（2）显色取上清液2 mL，加0.6% TBA 2 mL，混合后在100水浴上煮沸30 min，迅速在冰浴上冷却后再离心一次。分别测定上清液在532 nm和600 nm处的吸光度值，MDA质量摩尔浓度(nmol/g)=( A532-A600)VZV1/(0.155WV2)式中：VZ: 反应液总量(4 mL)； V1: 提取液体积(10 mL)； V2: 测定用用提取液量(2 mL)； W: 取样叶鲜重(g)0.155:为MDA的消光系数（nmol/l）试剂： 1、10三氯乙酸：称取三氯乙酸55.5556g加水溶解定容至500ml2、0.6硫代巴比妥酸（用10三氯乙酸配制）：称0.6707g TBA加10TCA溶解定容至100ml（4贮存）仪器：移液管(2、10 mL)；离心机；10 mL离心管五、SOD活力测定(NBT还原法)植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2.）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸（VC）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2.、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。超氧自由基（O2.）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.），生成H2O2和O2。H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂（一） 仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。（二）试剂（1）0.1 mol/L pH7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液：A液（0.1 mol/L Na2HPO4溶液）：准确称取Na2HPO4 12H2O（MW=358.14）3.5814g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4冰箱中保存备用。B液（0.1 mol/L NaH2PO4溶液）：准确称取NaH2PO4 2H2O （MW=156.01）0.780g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入50mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4冰箱中保存备用。取上述A液183mL与B液17mL充分混匀后即为0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液。4冰箱中保存备用。（2）0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g于100mL小烧杯中，用少量0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。4冰箱中保存可用12d。（3）7.5 104 mol/L NBT溶液准确称取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。4冰箱中保存可用23d。（4）含1.0mol/L EDTA的2 105 mol/L核黄素溶液A液：准确称取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。B液：准确称取核黄素（MW=376.36）0.0753g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。C液：合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液为含0.1mmol/L EDTA的2mmol/L 核黄素溶液。4冰箱中保存可用810d。该溶液应避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，置于4冰箱中保存。当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0mol/L EDTA的2 105 mol/L 核黄素溶液。（5）0.05 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液取0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液50mL，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4冰箱中保存备用。三、实验步骤 1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的0.05 mol/L pH7.8磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。 2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：依次加入0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5ml，130mmol/L Met溶液0.3ml，750mol/L NBT溶液0.3ml，100mol/L EDTANa2液0.3ml，20mol/L 核黄素0.3ml，蒸馏水0.5ml。2支测定管加酶液0.1ml（2支对照管以缓冲液代替，加0.1ml），混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min，然后立即遮光，以遮光管为对照调零，于560nm下测定光密度。（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。3.SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。四、结果计算 已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性(AckAE)V/(Ack0.5WVt)SOD比活力SOD总活性/蛋白质含量上式中：SOD总活性以每克鲜重酶单位表示； SOD比活力：单位以酶单位mg蛋白表示Ack：照光对照管的吸光度 AE：样品管的吸光度V：样品液总体积（ml） Vt测定时样品用量（ml）W：样鲜重（g） 蛋白质含量单位为：mg蛋白g鲜重六、过氧化物酶活性测定过氧化物酶是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶,它们能催化很多反应. 过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶。主要存在于细胞的过氧化物酶体中,以铁卟啉为辅基,可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物,具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。一、目的过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视。通过本实验学习并掌握过氧化物酶活性测定的原理及方法。二、原理过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，红棕色的物质可用分光光度计在470nm处测定其消光值，即可求出该酶的活性。三、实验材料、主要仪器和试剂1仪器（1）分光光度计（2）移液管（3）离心机（4 000r/min）（4）秒表（5）研钵（6）天平2酶液提取： 清洗干净叶片擦干，称取0.25g叶片，剪成小段，放入研钵加入适量10%PVPP（除去酚类物质）、石英沙、及2ml 50mmol的PH7.8(5.5-7.5)的磷酸缓冲液PBS（0.02-0.1mmol）进行研磨，磨碎后在加入2mlPBS溶液洗涤研钵一并装入离心管内，4下12000rmin-1离心2min，收集上清液4保存备用。3.显示反应采用愈创木酚（邻甲氧基苯酚）比色法（张宪政，1992）：取60ul提取液，加4ml 20 mmol/L愈创木酚和5ul 30%过氧化氢，混匀，测470nm波长下吸光度值，每隔30秒读数一次，一共6次，用蒸馏水代替酶提取液调零，酶活性以每分钟内每克鲜重材料的吸光度值变化表示，即过氧化物酶活性OD470 u/(min.g) =（A470VT）/（WVS0.01t）式中：A470为反应时间内吸光度的变化，W为叶片鲜重g，t为反应时间min，Vt为提取酶液总体积ml，Vs为测定时取用的酶液体积ml。4.附注1酶的提取纯化需在低温下进行。2酶的活力测定时：（1）保持待测材料的酶活；（2）测定时注意控制反应时间实验7、过氧化氢酶的活性测定紫外吸收法一、原理H2O2在240nm