荧光光度法.doc

荧光分析法测定维生素B2药片含量一 实验目的1. 掌握荧光分析法测定维生素B2含量的原理及方法。2. 熟悉荧光分光光度计的结构和使用方法。二 基本原理维生素B2（即核黄素）的溶液在430440nm蓝光照射下，会发黄绿色荧光，荧光峰值波长为535nm。在pH67的溶液中荧光最强，在pH11时荧光消失。醋酸溶液中荧光强度将会增强。其它条件一定时，维生素B2的稀溶液（0.55g/ml）的荧光强度与荧光物质的浓度成正比。本实验采用标准曲线法。利用维生素B2可被还原剂（连二亚硫酸钠）还原为非荧光性物质，通过测定加还原剂前后样品液的荧光强度，来消除可能的样品基体干扰，基于上述原理来测定药片的维生素B2含量。三 仪器与试剂（一） 仪器荧光分光光度计，样品池（石英），10ml刻度吸管，10ml具塞比色管（二） 试剂维生素B2贮备液（100g/ml）避光操作，精确称取100mg维生素B2(生物试剂，避光干燥保存)置于250ml烧杯中加冰醋酸10ml及蒸馏水90ml在水浴上加热溶解后，放冷，转入1000ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，移入棕色瓶中放暗处保存。维生素B2标准应用液（1.0g/ml）实验当天用移液管准确吸取标准贮备液5.0ml于500ml棕色容量瓶中，用1%醋酸溶液稀释至刻度，摇匀。1%醋酸溶液取1ml冰醋酸用去离子水稀释至100ml。连二亚硫酸钠（AR，保险粉）四 操作步骤1. 样品药液制备1）取核黄素药片10片，研细，称出适量（约相当于维生素B210mg）置于250ml烧瓶中加冰醋酸10ml，加蒸馏水90ml，置水浴上加热约1小时，并时时振摇使其溶解澄清后放冷，转入1000ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，移入棕色瓶中避光保存。该样品药液含维生素B2 10g/ml。2）用移液管准确吸取维生素B2药液10ml于100ml容量瓶中，用1%醋酸液稀释至刻度，摇匀，取此溶液10ml于比色管中，按与标准系列同样步骤测定此溶液的荧光强度。2. 标准系列的配制取10ml比色管6支，按下表配制标准系列管：管号012345维生素B2标准应用液（1.0g/ml）0.02.04.06.08.010.01%醋酸溶液10.08.06.04.02.00.03. 仪器调试1） 接通仪器及电源开关，再打开电脑及工作站。2） 取标准系列浓度最高管（5号管），固定荧光波长535nm，在350500nm的波长范围内，扫描不同激发波长下的荧光强度，得到以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标的激发光谱，确定激发光波长ex。3） 固定激发光波长ex，在450600nm的波长范围内，扫描不同荧光波长下的荧光强度，得到以荧光的波长为横坐标，荧光强度为纵坐标的荧光光谱，确定荧光波长em。4. 测定1） 在ex和em固定的条件下，将摇匀后的标准系列管，按浓度由低到高依次倒入样品池中，分别测出荧光强度并记录填入下表中。以荧光强度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。管号012345维生素B2浓度（g/ml）0.000.200.400.600.801.00FnFn-F02） 相同条件下测定样品液荧光强度，记为F样。再在测定过的样品液中加入保险粉约1020mg，轻轻摇动后迅速倒入样品池中，测定荧光强度，记为F空白（30秒钟之内测完）。以F样-F空白值在标准曲线上查出相应的维生素B2浓度。3） 测试完毕后，关闭电脑及工作站，再关闭仪器及电源开关。五 注意事项1. 连二亚硫酸钠能将荧光型维生素B2还原为非荧光型维生素B2，但不可多加，否则将其它还原性物质还原使测定结果偏高。同时，加入保险粉后应立即测定荧光强度，否则维生素B2又被氧化为荧光性，且多加或长时间后溶液会出现沉淀。2. 为防止维生素B2见光分解，实验应注意避光。3. 荧光测定中的样品池为四面皆光面的方形石英玻