血清蛋白的分离、提纯与鉴定.doc

血清清蛋白、-球蛋白的分离、提纯于鉴定1、 实验目的： 1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术2、 实验原理： 蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。对于不同的蛋白质，其分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用不同蛋白质在这些性质上的差别，利用相应的物理方法可分离纯化不同蛋白质。A.盐析法：在蛋白质溶液中加入大量中性无机盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。同时，加盐后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，从而破坏了蛋白质的胶体性质，导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间易于聚集沉淀，进而使蛋白质从水溶液中沉淀析出。B.凝胶层析：利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadeG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒网孔，而分子量小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔中，因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而达到去盐的目的。C.离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 D.纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳）：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此电泳时可将它们分离为清蛋白、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白5条区带。3、 材料与方法A材料样品：人混合血清试剂：葡聚糖凝胶（G-25)层析柱、DEAE纤维离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、醋酸铵缓冲溶液、20%磺基水杨酸、1%BaCl2溶液、氨基黑染色液、漂洗液、pH8.6巴比妥缓冲溶液、电泳仪、电泳槽B实验步骤盐析（粗分离）葡聚糖凝胶层析（脱盐）DEAE纤维素离子交换层析（纯化）醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）具体操作流程示意：（一） 盐析+凝胶柱层析除盐：取血清0.8ml，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀室温放置10min，4000r/min离心10min上清液（含清蛋白、少量球蛋白和球蛋白)沉淀（含球蛋白）加水 0.6ml溶解过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.07cm）过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.07cm）用1ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液洗脱，流出液量约1ml时开始检测蛋白质用1ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液(2ml)洗脱，流出液量约1ml时开始检测蛋白质 磺基水杨酸检测蛋白质 磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的峰液12滴收集含有蛋白质的峰液12滴继续用 2ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液洗涤继续用2ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液洗涤BaCl2检测SO42-阴性 BaCl2检测SO42-阴性用2-3ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液再生平衡用2-3ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液再生平衡（二） 离子交换层析（纯化）：除盐后收集的球蛋白过DEAE-纤维素层析柱（1.06cm）用1ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液(3ml)洗脱，流出液量约1ml开始检测蛋白质取浓度最高的1管作纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法）磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的洗脱液每管10滴，连续收集3管除盐后收集的清蛋白过DEAE-纤维素层析柱（1.06cm）DEAE-纤维素柱不用再生，可直接用于纯化清蛋白用1ml 0.0mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,用约mL 0.06mol/L NH4AC缓冲液流洗，除去球蛋白和球蛋白 磺基水杨酸检测蛋白质收集含有清蛋白的洗脱液每管10滴，连续收集2管DEAE-纤维素柱先用6ml l.5mol/L NaCl - 0.3mol/L NH4AC溶液流洗，再用10ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液流洗再生平衡2管均作纯度鉴定(醋酸纤维素薄膜电泳法)（三）醋酸纤维素薄膜电泳：1、点样（如下图）： - 点样线 +2cm 点样区 （粗面）1.5cm 点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多 2、电泳：薄膜粗面向下点样端置阴极端两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平电压：110V时间：50min 3、染色和漂洗：电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。 取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换2次），至背景颜色脱净为止。 取出膜，用滤纸吸干即可。注意事项：1、所用血清应新鲜，无沉淀物及细菌滋生。2、使用时勿将各时段所应用的溶液浓度弄错。3、上样时，滴管应沿柱上端内壁加入样品，动作应轻、慢，勿将柱床冲起。流洗平衡时亦应如此。4、洗脱时应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，并注意层析柱不要流干，进入空气。5、切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查SO42-的BaCl2混淆，因二者与相应物质生成的沉淀均为白色。6、葡聚糖凝胶价钱昂贵，要回收再生,避免损耗，严禁倒掉!4、 结果与讨论实验过程中的现象：加样时：把饱和硫酸铵加入到血清后观察到溶液浑浊。溶液下层呈米黄色，上层呈淡黄色。离心后溶液分层为：下层为沉淀，呈乳白色。上层为清液，呈淡黄色。 原始实验数据：将4条经过染色的醋酸纤维素薄膜并列，使点样线位于同一水平。以正常血清蛋白图谱为对照，观察提纯的物质属哪种蛋白。所得的照片如下图：结果：从电泳图谱中可以看出，血清样品的电泳分离情况并不理想，除清蛋白外，1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白这4条区带未能清晰分离。对于清蛋白第1管和清蛋白第2管，其电泳结果与血清的清蛋白电泳图谱几乎一致，可以确定管内的蛋白质为清蛋白，同理球蛋白管内的蛋白质为-球蛋白。讨论： 1，对于血清样品的电泳图谱中4条球蛋白区带分离情况不佳的情况，其可能为在滴加血清样品时滴加过多，使得球蛋白的4条区带彼此靠近而导致分离情况不佳的情况发生。2，对于清蛋白管和球蛋白管中区带颜色浅的情况，其可能为提纯操作中滴加洗脱液过多导致血清蛋白稀释过度，导致收集的提纯蛋白溶液的蛋白浓度降低而使得电泳所得区带颜色较浅。3，对于清蛋白1管中清蛋白区带弯曲的情况，其可能为未水平点样或电泳时薄膜为放正所致。结论：本次试验所获得的结果除血清样品的电泳图谱外基本与预期试验结果相一致。思考题：1.硫酸铵盐析一步,为什么是0.8ml血清加0.8ml饱和硫酸铵?答：因为清蛋白和球蛋白的盐析浓度不一样，使用半饱和硫酸铵溶液可以使球蛋白沉淀而清蛋白不沉淀，0.8ml血清和0.8ml饱和硫酸铵混合可以形成半饱和硫酸铵溶液从而达到分离的目的。2.为什么实验中DEAE纤维素柱分离-球蛋白后不用再生,可直接用于纯化清蛋白?答：因为缓冲液相同并且分离球蛋白后DEAE纤维素柱的成分没