荧光光度法测定硫酸奎尼丁含量.docx

实验三 荧光光度法测定硫酸奎尼丁含量 实验目的和要求：1.掌握荧光分光光度计的基本结构及操作方法；2.了解荧光产生及测量的过程；3.掌握荧光分析法的定量分析方法（标准曲线法）；4.掌握影响荧光强度的因素。实验原理： 硫酸奎尼丁结构分为喹啉环和喹啉碱两个部分，根据其喹啉环结构部分具有产生荧光的特性，采用荧光光度计测量其荧光强度，可实现硫酸奎尼丁含量的测定。实验仪器与试剂：1.F93型荧光光度计 2.硫酸奎尼丁标准储备溶液（100g/ml） 3.硫酸溶液（0.050mol/L） 4.硫酸奎尼丁样品溶液5. 50ml容量瓶6个 6. 5ml移液管2只 7. 1cm石英荧光比色皿1个实验步骤：1.标准系列溶液及样品溶液配制： 按照下表配制硫酸奎尼丁标准系列溶液及样品溶液编号123456（硫酸奎尼丁样品溶液）100g/ml硫酸奎尼丁标准溶液1.00ml2.00ml3.00ml4.00ml5.00ml2.50ml说明以上溶液均用移液管移取至50ml容量瓶中，用0.050mol/L硫酸溶液稀释至刻度并摇匀系列标准溶液浓度2g/ml4g/ml6g/ml8g/ml10g/ml2.测定灵敏度选择: 以5号溶液作为测定溶液，置于荧光光度计样品室中，盖上样品室舱盖，改变荧光波长，测定荧光强度，比较最大荧光强度。调节灵敏度值，使最大荧光强度读数在100左右。确定测定灵敏度。3. 荧光光谱的绘制 将荧光波长调节为380nm，用1cm石英荧光比色皿，以5号溶液作为测定溶液，置于荧光光度计样品室中，盖上样品室舱盖，然后按照下表依次调节荧光波长，测定荧光强度；以测定的荧光强度为纵坐标，荧光波长为横坐标制图，绘制荧光光谱，并从荧光光谱曲线上找出最大荧光波长。（激发波长为365nm）荧光波长（nm）380390400410420430440450460荧光强度值2.57.921.543.063.077.584.382.573.0荧光波长470480500510520530540550560荧光强度值64.056.133.222.815.19.55.73.52.2 选择的最大荧光波长为：=440nm绘制的荧光光谱如下：4.标准曲线制作： 将荧光波长调节为上面实验选择的max，荧光光度计灵敏度为上面实验选择的灵敏度档次；用1cm石英荧光比色皿，装入0.050mol/L硫酸溶液，置于荧光光度计样品室中，盖上样品室舱盖。然后按照下表依次测定标准系列溶液和样品溶液荧光强度，平行测定三次，计算荧光强度的平均值；以荧光强度的平均值为纵坐标，系列标准溶液的浓度为横坐标制图，绘制标准曲线。编号123456空白溶液(F0)荧光强度F119.538.554.570.084.023.60.4荧光强度F219.538.454.270.083.623.60.4荧光强度F319.538.354.269.983.423.40.4F平均值19.538.454.370.083.723.50.4溶液实际的荧光强度（F-F0）19.138.053.969.683.323.10绘制的标准曲线如下：实验数据处理：1.样品溶液中的硫酸奎尼丁含量计算：根据6号样品溶液荧光强度测定的平均值，在标准曲线上采用作图法求出其对应的浓度值，采用下式计算样品溶液中硫酸奎尼丁的含量：Cx=c读取值50.00/2.50 =2.2950.00/2.50 =45.8g/ml实验讨论：1. 此实验操作的关键是荧光分光光度计灵敏度的选择，在实验刚开始的时候，选择的灵敏度太小，五号溶液不同的荧光波长下荧光强度的最大值也只有二十几，所以重新选择了一档较高的灵敏度。2. 实验中之所以用五号标准溶液确定灵敏度是因为五号溶液浓度最高，荧光强度最大，只要五号溶液在不同波长下的最大荧光强度在100左右，那么其他溶液的荧光强度也必定在仪器的测定范围之内。3. 切记实验中在选定灵敏度档次后就不能再改变，也就是说所有的测定必须在同一个灵敏度下进行。4. 荧光强度应该是相对荧光强度，它的数值没有意义，只是具有比较性。5. 光谱法中，绘制标准曲线需要五个点，也就是需要配制五种不同浓度的标准系列溶液。6. 为了绘制准确的标准曲线，求出较准确的样品溶液中的硫酸奎尼丁含量，一定要用稀硫酸作空白溶液用来实现试剂参比。7. 配制标准系列溶液和样品溶液的时候，用硫酸溶液稀释而不用蒸馏水，是因为激发光的波长为365nm的时候，经查阅文献得到，水与光子碰撞产生的拉曼光的波长为416nm，而实验测得的