6、离子交换法提取庆大霉素的工艺研究.doc

实验九、十 离子交换法提取抗生素的工艺研究一、实验目的和要求1.了解例子交换树脂的工作原理和工艺条件的选择。2.以庆大霉素为实验对象，研究pH对交换容量的影响，并作树脂的吸附流出曲线和解吸曲线。二、实验原理 庆大霉素（gentamicin）是由小单孢菌（Micromonospora purpurea和Mechinospora）产生的一族氨基糖苷类抗生素。对革兰氏阴性菌有高度的抑菌作用，对绿脓杆菌（铜绿色假单胞菌）、肠道杆菌、金黄色葡萄球菌感染的疾病疗效显著，在临床上应用广泛。庆大霉素为多组分复合物，其中具有疗效的是C族组分，主要为C1、C2、Cla等，结构式和某些物性常熟见表1.表1 庆大霉素C族组分的某些物性常数分子式相对分子质量比旋度熔点庆大霉素C1C21H42N5O7477.60+158（Cl，H2O）94-100庆大霉素C2C20H41N5O7463.58+160（Cl，H2O）107-124庆大霉素C1aC19H39N5O7449.55庆大霉素C复合物硫酸盐+102（Cl，H2O）225-230庆大霉素分子中含有多个氨基和羟基，故为碱性水溶性抗生素，易溶于水和某些极性溶剂(如吡啶、二甲基甲酰胺等)，在甲醇、乙醇和丙酮中有中等溶解度，不溶于醚、苯和卤代烃。庆大霉素属于稳定性很好的抗生素，耐热，不怕酸碱。在pH2-12的水溶液中，于100，加热30min，活性无显著变化。Ph4.0稳定性好，酸性下稳定性相对价差。庆大霉素为中等强度的五元碱性抗生素，分子结构中有5个氨基C1组分的pK值分别为6.65、7.55、8.31、9.22、9.95，在不同pH的水溶液中可以6种电化学状态存在，当pH4.5时，庆大霉素电离成5价正离子；当pH12时，以游离分子状态存在，故可采用离子交换法进行提取。在溶液pH较低的条件下，将庆大霉素交换吸附到树脂上；在pH碱性的条件下，将其从树脂上洗脱下来，本实验采用4%氨水洗脱。庆大霉素的碱性性质决定了它应该采用阳离子交换树脂。本实验选择大孔弱酸DK110阳离子交换树脂（丙烯酸型），树脂的pK值为5.7左右。它对庆大霉素的交换容量大，解吸容易，洗脱峰集中。DK110树脂对庆大霉素的吸附和洗脱的交换反应式如下（式中Gen表示庆大霉素）：交换吸附：洗脱：弱酸性DK110树脂交换吸附庆大霉素时，溶液的pH对交换容量影响很大。适宜pH的选择应从三方面考虑：使树脂解离，生化物质解离，在生化物质稳定的范围内。对于弱酸性树脂适宜的pH必须同时满足这3个条件。料液由恒流泵打入离子交换柱，调节泵的转速使达到所要求的料液流速，经离子交换后的流出液由自动部分收集器分段收集，设定每管收集时间，使每根试管中的体积达到预定的数植（或者利用部分收集器的计滴程序，使每根试管达到预定的体积）。三、实验器材与试剂（一）器材：离子交换层析柱，恒流泵（蠕动泵），自动部分收集器，pH酸度计，自动旋光仪，烧杯和量筒等。（二）试剂：庆大霉素成品和标准品，DK110树脂，浓氨水，NaOH和HCl等。四、操作方法（一）溶液pH对庆大霉素交换容量的影响1树脂的预处理和再生取一定量的树脂于烧杯中，用清水漂洗除去悬浮的杂质，新树脂用70左右热水浸泡，洗至水无色透明为止，然后装入层析柱。从柱顶通入1mol/L NaOH洗，用量约为5倍床层体积，每分种流量为树脂床层体积的1/251/15。用去离子水洗至流出液pH8-9为止。再用1mol/L HCl洗，HCl用量和流速均与NaOH洗相同，用水洗至中性，最后通入1mol/L氨水使树脂转为氨型，并用水洗至pH9左右，即可投入使用。使用过的树脂再生时可先用HCl洗，再通入氨水洗，同时转型。2料液配制称取一定量庆大霉素成品毛粉，溶于去离子水中，根据成品效价计算加水量，使配成的溶液约5000U/ml。用旋光法测定实际效价。用6mol/L NaOH或6mol/L H2SO4分别调节溶液pH5、6、7、8、9、10左右。3交换吸附用10ml量筒量取10ml树脂（树脂充分沉降后的体积，作为读数标准），共6份，小心装入6支层析柱中，量取一定体积不同pH的料液，用恒流泵分别通入柱中，调节泵速，保持每分钟流量为树脂床层体积的1/50，将流出液收集在烧杯中，收集一段时间后，经常测定流出液效价，待流出液浓度与进口液基本相等时，树脂达到饱和，停止通液，通入10ml去离子水洗涤树脂，将树脂表面和间隙的庆大霉素顶出柱，洗涤流出液合并入吸附流出液中，量体积和测效价，按下式求交换容量：（3-8-1）式中：V1和U1分别为通入柱的料液体积（ml）和效价（U/ml） V2和U2分别为流出合并液的体积（ml）和效价（U/ml） V柱中树脂的体积（ml）以pH为横坐标，对应的交换容量为纵坐标，作曲线图，选择交换容量大的pH作为吸附的适宜pH。（二）吸附流出曲线和解吸曲线的绘制1吸附流出曲线将10ml树脂装入柱中。配制5000U/ml左右的庆大霉素成品液，并调pH至上述已确定的适宜值，用恒流泵将其通入柱中，调节泵速，保持每分钟流量为树脂床层体积的1/50，用部分收集器分段收集流出液，每10ml收集一管，测其效价。当流出液浓度与进口液基本相等时停止收集。以流出液体积为横坐标，对应管号的效价为纵坐标，作离子交换吸附流出曲线图。2洗脱曲线将吸附后的树脂通入15-20ml去离子水洗涤，洗涤水弃去，然后用恒流泵通入4%氨水洗脱，控制每分钟注量为树脂床层体积的1/150-1/100，用部分收集器分段收集洗脱流出液，调节每管时间，使达到2-3ml/管，洗脱液稀释后测效价。以洗脱流出液体积为横坐标，对应管号的效价为纵坐标，作洗脱曲线图。注：以上实验也可同时用强酸性732号阳离子交换树脂按相同方法试验，进行比较。（三）旋光法分析效价1标准曲线的制作精确称取庆大霉素标准品4.0-4.5g二份，分别用去离子水溶解并定容至100ml，从中吸取8、16、24、32、40ml于50ml容量瓶中，然后用水稀释至刻度并混匀，配成不同浓度的标准溶液，用旋光仪分别测旋光度。以浓度（U/ml）为横坐标，旋光度为纵坐标作图，得到一直线，作线性回归，求线性方程和R2。2样品分析样品分析当稀释后测旋光值，并根据标准曲线求效价。五、思考题（一）预习1根据庆大霉素的理化性质，说明为什么可以选择DK110树脂进行提取。2为实验原始数据的取得列表。（二）