![肺泡巨噬细胞的制备及RNA提取.doc_第1页](http://file.renrendoc.com/FileRoot1/2020-1/19/7f92cd46-ec59-4f33-888e-76de61cda738/7f92cd46-ec59-4f33-888e-76de61cda7381.gif)
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PAM (肺泡巨噬细胞) 的制备一、 准备工作1、 高压灭菌好的1PBS两瓶(1000ml/瓶)、小托盘1个、500ml烧杯2个、大剪刀1把、镊子2把和50ml离心管若干。另需准备好解剖小猪用的手术刀片、棉线等。2、 细胞培养液的配备生长液:10%胎牛血清+DMEM培养基+双抗+两性霉素二、 制备细胞1、 将小猪腋下放血致死2、 从颈部剖开腹腔,避免伤到气管和肺脏3、 用棉线结扎气管上部,然后剪断气管,将气管和肺脏完整取出来,放到准备好的大烧杯中4、 转移到细胞培养室,用PBS冲洗干净肺脏表面,弃除杂物5、 在操作工作台上用灭菌好的剪刀剪断结扎了的气管。(以下步骤需无菌操作)6、 吸取PBS灌进肺内,充盈后,用手轻轻捏揉肺叶数次后,把肺内液体倒出到蓝盖瓶中。7、 重复灌洗2次8、 将所收集的液体分装到50ml离心管中,42000g、10min离心9、 视情况可以将沉淀细胞再用PBS或培养基清洗离心1次10、在细胞沉淀中,加入2ml Trizol试剂,用移液器充分吹打、混匀,直到形成清亮不粘稠的液体(表明细胞被充分溶解,基因组DNA被充分打断)。11、 后续可按Trizol试剂的标准操作抽提总RNA。也可以把此Trizol试剂保存在冰箱中保存。RNA抽提第二阶段:分离阶段6加入0. 2 ml 氯仿,剧烈混匀20 s ,室温放置10 min 。710 000 rpm/min ,4 离心15 min。第三阶段:RNA的沉淀8吸取上清于5 ml 离心管中,加入0.5mL异丙醇(预冷)颠倒混匀5 次,室温放置10 min 。(注意:在吸取上清时,切不可将上清与酚交界处的蛋白及下面的酚吸起,造成RNA的污染)910 000 rpm/min ,4 离心10min。(RNA沉淀在离心后形成胶质片状沉淀附着于试管壁)第四阶段:RNA的漂洗10去上清,沉淀用1ml 75 %乙醇漂洗,振荡,7 000 rpm/min ,4 离心10 min,倒净乙醇。11RNA 沉淀加入0.5 ml无水乙醇漂洗,振荡,7 000 rpm/min ,4 离心5 min,倒净无水乙醇。(缩短RNA沉淀晾干的时间,避免RNA在空气中暴露时间过长而增加外源性Rnase对RNA的降解)第五阶段:RNA的再溶解12在超净工作台上平放离心管,待离心管管壁无明显液滴时加入50 l DEPC 处理的灭菌双蒸水,在55-600C温育10min,溶解RNA 沉淀。 13将溶解充分的RNA溶液转移到1.5ml离心管中,做好标签,放入-800C的冰箱中保存备用。总RNA检测及浓度测定 总RNA的完整性可通过普通琼脂糖凝胶电泳检测,过程如下:1. 制备1.2琼脂糖凝胶:将1.2g琼脂糖溶于1TAE中,稍加冷却,加入少许EB,混合均匀后,灌制凝胶,待凝胶凝固好后,即可使用。2. 点样:取2L总RNA与2L Gel Loading Buffer及6L DEPC水混合后点于点样孔中,15V/cm,电泳20min。3. 拍照:电泳结束后,用紫外透射仪观察,并用凝胶成像系统成像。4. 用紫外分光光度计测量总RNA样品浓度,每个3次,取平均值。5. 根据所测浓度,用DEPC水稀释每个RNA样品浓度至1g/L,其余样品保存在超低温冰箱备用。 总RNA反转录 根据TIANGEN TIANScript RT Kit cDNA 第一链合成试剂盒,其操作步骤如下:1) 在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物:15g总RNA,2L oligo(dT)15 , 2LdNTP(2.5mM each),补RNase-free ddH2O定容至13.5 L。2) 70加热5分钟后迅速在冰上冷却2分钟,简短离心收集反应液后加入一下各组分:4L 5First-Strand Buffer,1L 0.1 M DTT,0.5L RNasin.3) 加1L(200U)TIANScrip
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