第九讲 黄酮类分析.doc

第九讲 黄酮类分析基本结构 2苯基色原酮（见课本） 黄酮类化合物苷元的主要结构类型（见课本）常见富含黄酮药材 黄芩黄芩苷；葛根葛根素；淫羊藿淫羊藿苷；银杏叶山奈素；槐米芦丁结构与性质 多为结晶 其是否呈色与分子结构有关如双氢黄酮，由于2，3位饱和，不存在交叉共扼体系，多为无色。 异黄酮类共轭系统减小，仅显微黄色。 花色素所显颜色与pH值有关，pH值小于7显红色，等于8.5则显紫色，大于8.5为蓝色。黄酮类化合物在紫外光下有无荧光及荧光颜色与分子结构有关。 溶解性 游离黄酮类化合物一般难溶或不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂，具酚羟基的可溶于稀碱水。黄酮甙类一般易溶于热水、甲醇、乙醇、吡啶及稀碱水，极性小的黄酮甙也可部分溶于乙酸乙酯中。 酸碱性 黄酮类化合物若具有酚经基则显酸性，其酸性强弱与酚羧基的位置及数目多少有关。鉴别方法(一)还原反应 盐酸镁粉反应 是检查中药中是否有黄酮类化合物的最常用方法之一。在样品的乙醇或甲醉溶掖中加人少量镁粉振摇，再滴入几滴浓盐酸，12分钟(必要时水浴上加热)即显出颜色。 钠汞齐还原反应 向黄酮类化古物的乙醇溶液中加入钠汞齐，放置数分钟至数小时或加热，过滤，滤液用盐酸酸化，则黄酮、二氢黄酮、异黄酮、二氢异黄酮类显红色，黄酮醇类显黄淡红色，二氢黄酮醇类显棕黄色。 四氢硼钠还原反应 二氢黄酮、二氢黄酮醇类可被四氢硼钠还原生成红紫红色的物质。(二)与金属盐类试剂的络合反应 黄酮类化合物中若具有3羟基、4羰基或5羟基、4羰基或邻二酚羟基，则可以与许多金属盐类试剂如铝盐、铁盐、锆盐、镁盐、铅盐等反应，生成有色的络合物。(三)与碱反应 黄酮类在冷和热的氢氧化钠水溶液中能产生黄棕红色 查耳酮类在碱液中能很快产生红或紫红色 二氢黄酮类在冷碱中呈黄橙色，放置一些时间或加热则呈深红到紫红，此系开环后变 成查耳酮类之故 黄酮醇类在碱液中先呈黄色，当溶液中通入空气后，因3位羟基易氧化，溶液即转变为棕色。三个羟基相邻的黄酮类化合物色谱鉴别 黄酮类化合物的色谱鉴定主要有硅胶薄层色谱法、聚酰胺薄层色谱法和纸色谱法。(一)硅胶薄层色谱法可用于游离黄酮和黄酮甙类的鉴定，这是一种吸附层折，化合物Rf值大小与化合物极性大小有关，Rf值小，化合物极性大，Rf值大，化合物的极性小。硅胶薄层层析法展开剂，游离黄酮常用有机溶剂系统，如甲苯氯仿丙酮(40:25:35) 黄酮甙类常用含水或酸水有机溶剂，如乙酸乙酯丁酮甲酸水(5:313:1)。(二)聚酰胺薄层色谱法 可用于分离游离黄酮和黄酮苷类 分离游离黄酮 常用的展开剂多为有机溶剂(如苯丁酮甲醇，6:2:2)。此时聚酰胺主要表现为吸附层析。Rf值大小排列次序同硅胶层析法； 分离黄酮甙类 常用含水的有机溶剂为展开剂。此时聚酰胶主要表现为氢键的吸附作用，化合物被吸附的强弱与结构中酚羟基的多少、共轭系统的大小及酚羟基是否形成分子内氢键等因素有关。(三)纸色谱法为分配层析。可用于游离黄酮和黄酮苷类的鉴定。展开剂常用两类： 一类为酸性展开剂，此时极性小的化合物要比极性大的化合物在展开剂中分配多，因此Rf值亦较大 另一类展开剂为水性展开剂，常用2一6乙酸，乙酸浓盐酸水(30:3:10)等。此时极性小的化合物要比极性大的化合物在展开剂中分配少，而极性大的化合物要比极性小的化合物在展开剂中分配多，因此Rf值极性大的比极性小的要大。紫外光谱鉴别 两个主要吸收带组成，出现在300一400nm之间的吸收带称带I，出现在240一280nm之间的吸收带称带II。 (1)甲醇钠：甲醇钠碱性较强，可使黄酮类化合物母核上所有酚羟基解离。吸收带向红位移。 (2)乙酸钠：乙酸钠的碱性比甲醇钠小，只能使黄酮类化合物母核上酸性较强的醇羟基解离， 导致相应的吸收带向红位移。 (3)乙酸钠硼酸：黄酮或黄酮醇类化合物A环或B环上如果具有邻二酚羟基时(5，6位邻二酚经基除外)，在NaAc碱性下可使相应吸收带向红位移。(4)三氯化铝及三氯化铝盐酸：可与具有3羟基、4羰基或5羟基、4羰基的黄酮或黄酮醇类化合物作用生成络合物，使带I或带II红移。异黄酮、二氢黄酮和二氢黄酮醇类在甲醇中的UV光谱特征 在这三类化合物中都有苯甲酰系统，都具有强的带II吸收，而异黄酮无桂皮酰系统，所以它的紫外光谱带I以肩蜂或低强度吸收峰出现，很容易与黄酮及黄酮醇区别。查耳酮类在甲醇中的UV光谱特征 查耳酮的紫外光谱特征是带I的吸收强，为主峰，而带II吸收弱。含量测定 紫外分光光度法 以芦丁为代表测定总黄酮,272nm 薄层色谱法 高效液相色谱法 比色法 以芦丁为代表测定总黄酮, 500nm 电化学方法：极谱法 荧光法 非水滴定法以芦丁为对照品的比色法测定总黄酮含量： 精密量取供试品溶液及芦丁对照品溶液各2ml分别置于10ml量瓶中，加入甲醇适量使成5ml。同时做空白一份。往上述溶液分别加入5%亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，静置6min；再加入10%硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，静置6min；接着加入4%氢氧化钠溶液4.0ml，用水稀释至刻度，摇匀，静置15min后，用紫外-可见分光度计于400700nm扫描。结果显示供试品溶液和芦丁对照品溶液于500nm附近均有最大吸收，故测定波长确定为500nm。. 示例 山楂黄酮成分的质量研究 山楂总黄酮的提取 总黄酮的鉴别试验 总黄酮的含量测定 黄酮主要成分的分离分析国外使用的山楂品种主要是英国山楂和单子山楂。中国药典规定的山楂品种为蔷薇科植物山里红和山楂的干燥成熟果实。此外使用的还有野山楂、云南山楂等。山楂具有消食健胃、行气散瘀之功效。另外，具有强心，增加冠状动脉血流量，降低血压，减少血中胆固醇沉着等作用，近年来在治疗心血管疾病方面也有着广泛用途。山楂中的主要成分为有机酸和黄酮化合物。目前研究的药用部位有果实、叶、花、核等。本工作主要是研究北山楂果实中的黄酮成分。山楂总黄酮的提取方法 干果或鲜果 70%乙醇热提3小时 浓缩 水沉 过滤 乙酸乙酯萃取 分取乙酸乙酯层，加入无水硫酸钠脱水干燥 过滤 浓缩至干，得黄色固体粉末，此即黄酮粗品总黄酮的鉴别试验 盐酸-镁粉反应 与金属盐类试剂如三氯化铝、二氯氧锆、醋酸铅、三氯化铁的反应 与碱性试剂如氢氧化钠、碳酸钠、氨气的反应聚酰胺薄层色谱 固定相：聚酰胺薄膜 展开剂：甲醇-水-乙酸(3:2:0.5) 检视方法：置于紫外灯365nm下，在比移值0.7处可看见蓝色荧光斑点；均匀喷以1%三氯化铝乙醇液，加热数分钟，置于紫外灯365nm下，在比移值0.4处可看见黄绿色荧光斑点；再均匀喷以5%硫酸乙醇液，加热数分钟，在可见光下于比移值0.5和0.2处各可看见红色斑点。比色法测定总黄酮含量 文献方法 存在问题：1、样品溶液显色稳定性差 2、以芦丁为基准总黄酮含量偏高 改进方法 溶液显色稳定性有了显著改善分别以芦丁和表儿茶素为基准物质计算总黄酮含量显色操作 文献方法：待测溶液置于10ml量瓶中 加入5%亚硝酸钠溶液0.3ml 静置6min 加入10%硝酸铝溶液0.3ml 静置6min 加入4%氢氧化钠溶液4.0ml，用水稀释至刻度，摇匀 静置15min 于500nm处测定吸收度。 基准物质：芦丁 改进方法：待测溶液置于25ml量瓶中 加入5%亚硝酸钠溶液1.0ml 静置6min 加入10%硝酸铝溶液1.0ml 静置6min 加入乙酸0.5ml 加入4%氢氧化钠溶液10.0ml，用水稀释至刻度，摇匀静置30min于413nm处测定吸收度。 基准物质：芦丁和表儿茶素讨论显色方法改进的依据：黄酮在碱性溶液中不稳定 当只加入乙酸，随着加入量的增加，吸收峰蓝移，吸收度随时间增加有上升的趋势； 当只加入氢氧化钠溶液，随着加入量的增加，吸收峰红移，吸收度随时间增加有下降的趋势； 当加入的乙酸和氢氧化钠溶液体积比为0.5：10时，溶液显色稳定性较好。其它情况下均较差。 样品溶液显色后的光谱行为与表儿茶素较为相似，而与芦丁差别较大。因此，山楂黄酮粗品中的主要黄酮成分可能与表儿茶素所代表的黄烷化合物结构相似，而与芦丁所代表的黄酮醇类化合物差异较大。 文献法和改进法测定的结果存在明显差异。由于文献法中样品溶液显色稳定性差，改进法样品溶液显色稳定性好，因此改进法的测定结果更为可信。 以芦丁和表儿茶素为基准物质而分别计算出来的总黄酮含量也存在明显的差异。由于样品显色后的光谱图与表儿茶素相似，因此选用表儿茶素作为基准物质更为合适。高效液相色谱法测定黄酮粗品酸水解物槲皮素的含量目的：确定芦丁、金丝桃甙、槲皮素等黄酮醇类化合物在黄酮粗品中所占的比例。 水解条件：水解温度85，硫酸浓度2%，水解时间1hr.色谱条件及系统适用性试验：色谱柱：日本岛津CLC-ODS柱（1504.6mm）; 流动相：甲醇-25mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（以磷酸调节pH值至2.5）(49：51, v/v); 检测波长：372nm; 流速：1ml/min; 理论塔板数按槲皮素峰计算应不低于2000.方法验证包括线性与范围、回收率试验、精密度试验等。标准曲线回归方程：A=6.01510 4 C-1.54510 4，相关系数为0.9999，槲皮素浓度在2.03740.74g/ml范围内与峰面积呈良好线性. 回收率为99.06%(n=9).进样精密度试验和重复性试验RSD%分别为0.75%和1.78%. 样品溶液在12小时以内稳定. 结论：黄酮醇类化合物所占的比例不是很高 。 高效液相色谱法测定黄酮粗品中表儿茶素的含量色谱条件及系统适用性试验：色谱柱：Shimadzu CLC-ODS柱（5m,6mm150mm）； 流动相：甲醇-3%乙酸(1：5, v/v)； 检测波长：279nm； 流速：1ml/min；理论塔板数按表儿茶素峰计算不低于7000.方法验证包括线性与范围、回收率试验、精密度试验等。标准曲线回归方程：A=18827C-6572.5，相关系数为 0.9999，表儿茶素浓度在5.008100.2g/ml范围内与峰面积呈良好线性. 回收率为99.20%. 进样精密度试验和重复性试验RSD%分别为1.33%和2.24%. 中间精密度试验RSD%为0.62%. 样品溶液在12小时以内稳定.结论：干果黄酮粗品和鲜果黄酮粗品中表儿茶素的含量存在着明显差异。造成鲜果和干果表儿茶素含量差异的原因可能是：1、在将山楂鲜果处理成干果的过程中，表儿茶素的分子结构受到了破坏，或发生了聚合生成了黄烷低聚物或鞣质； 2、随着放置时间的增加，表儿茶素发生了降解或聚合。黄酮粗品中黄酮醇类化合物和表儿茶素含量的比较表儿茶素的含量要明显高于芦丁等黄酮醇类化合物的含量。 表儿茶素是衡量黄酮粗品中黄酮含量的重要指标。有必要对不同产地、不同采集时间的山楂果实中的表儿茶素含量进行考察，从而为选取山楂来源提供依据。黄酮主要成分的分离（略）讨论 由于黄酮粗品中的化学成分过于复杂，采用单一的柱色谱无法实现黄酮成分的分离。 在表儿茶素分离中，采用聚酰胺柱色谱第一次粗分，硅胶柱色谱第二次细分，可得到纯度较高的表儿茶素。 在金丝桃甙的分离中，由于金丝桃甙在硅胶柱上拖尾严重，因此第二次分离仍采用聚酰胺柱色谱