己酸菌复壮培养技术试验与研究.doc

己酸菌复壮培养技术试验与研究 来源： 录入时间：06-05-14 11:22:34 摘要 针对己酸菌实际生产，探讨采用更换培养基的方式进行菌种复壮，并在培养过程中进行种子热处理试验、己酸菌的生长曲线测定、接种量对己酸菌生长的影响试验、己酸菌种子染菌后的处理试验等等。通过大量试验分析，得出较优的培养和检测方案，并将优良种子直接用于大生产。实践证明，具有很强的实用性和较大的技术参考价值。 关键词：己酸菌复壮培养 己酸菌培养是各大白酒企业近年来重要的科研项目，是窖池养护和人工窖泥培养的基础，也是提高白酒质量的重要环节。但在其生产及应用过程中，工艺还不是非常成熟，存在很多需要探讨研究的问题，需要寻找更佳的培养方案，以提高质量，降低成本。 在实际生产过程中，我们对己酸菌培养前期的各个环节进行了认真、多次的反复的研究，总结出了一套经济有效的己酸菌菌种复壮方法，通过种子热处理试验、接种量对己酸菌生长影响试验、进行己酸菌生长曲线测定，得出了最佳方案，并探讨出较好的检测记录方法。 1培养方案 1.1培养基的制备 1.1.1蛋白胨培养基 1.1.1.1蛋白胨1.5%，乙酸钠0.5%，葡萄糖0.5%，牛肉膏0.2%，磷酸氢二钾0.05%，硫酸铵0.03%，硫酸镁0.01%，调节PH7.07.2，于0.12MPa高压灭菌30分钟。 1.1.1.2称1%碳酸钙单独灭菌，接种前连同2%乙醇一并加入。 1.1.2乙酸钠培养基 1.1.2.1乙酸钠1%，酵母膏0.1%，硫酸铵0.05%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.02%，调节PH6.97.2，于0.12MPa高压灭菌30分钟。 1.1.2.2称1%碳酸钙单独灭菌，接种前一并加入2%乙醇。 1.2己酸菌种子培养方式 1.2.1复壮培养：取己酸菌种子100ml倒入150ml灭菌小三角瓶中，包扎后于90水浴中处理10分钟，然后立即倒入培养基中，摇匀后置于35恒温箱中培养710天。 1.2.2扩大培养：取己酸菌种子100ml直接加入乙酸钠培养基（1L）中，包扎摇匀后置于35恒温箱中培养5天，每天观察记录产气状况。 1.3采用蛋白胨培养基及乙酸钠培养基进行复壮种子对比试验结果 1.3.1采用蛋白胨培养基进行己酸菌种子的复壮培养，共进行3批，第六天测得结果为2.85、2.515、2.65亿/ml。 1.3.2采用蛋白胨培养基更换乙酸钠培养基的方式进行己酸菌种子复壮培养，菌数极多，只是菌体较为瘦弱。可以看出，采用蛋白胨培养基在技术上具有可行性，但用于大生产每吨成本达1339.6元，而乙酸钠培养基仅为160.5元，高7.3倍，用蛋白胨培养基不具有经济上的可行性。因此，考虑将蛋白胨培养基种子转接到乙酸钠培养基上，进行扩大培养。 1.3.3采用乙酸钠培养基培养己酸菌液，使用蛋白胨培养基种子予以转接，刚开始效果不甚理想，经多批次转接试验，最高达1.6亿/ml，正常培养较高时达1.31.4亿个/ml，完全满足生产需要，采用更换培养基的方式进行生产育种，操作简便，效果良好，具有实用性，生产中可半年至一年实施一次。 2己酸菌种子处理及取样检测方法探讨 2.1己酸菌种子热处理1 2.1.1热处理的目的：一是杀死杂菌及己酸菌繁殖体，纯化菌种；二是激活己酸菌种，促进其迅速繁殖。 2.1.2己酸菌热处理的方式：传统采用80热处理10分钟，但在实施中存在一个问题，实际温度是以水浴温度计为准，则实际达不到种子液80的温度要求，而以处理种子液测温操作较为不便，经反复试验，我们略作改进，采用90水浴处理，效果较为理想。 2.2己酸菌细胞数的检测方法2 2.2.1采用血球计数板方法 2.2.1.1取己酸菌液1ml加入9ml蒸馏水中，用吸管吸放数次。 2.2.1.2用吸管加1滴稀释的己酸菌液加于计数板上，然后用干净盖玻片轻轻自一边向另一边压下，再用两只手的手指紧压盖玻片两边，使盖玻片与计数板完全密合。 2.2.1.3数分钟后，待菌体细胞沉降到计数板表面，在40倍物镜下计数。 2.2.1.4计数时，在2516计数板上，取左上、右上、左下、右下及中间五个大格共80个小格的细胞数。计数时，凡大格线上的细胞只计上方及右方线上的细胞。 2.2.1.5计数完毕，将计数板在水龙头上冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干。 2.2.1.6计算：1ml己酸菌细胞数（80小格细胞数80）4001000010 80小格己酸菌细胞数500000 2.2.2关于血球计数板检测方法的优缺点 2.2.2.1使用计数板检测的缺点：由于己酸菌菌体小，仅为591.0nm左右，因此不能完全沉降到计数板表面，造成计数不完全，形成误差，使绝对误差的存在不可避免。 2.2.2.2使用计数板检测的优点：检测及时，能够很快反馈给生产班组指导生产；测量相对误差小，对于各批次之间的比较尤为适用；化验成本低，几乎不消耗药品。 2.3取样方式的确定 2.3.1静置取样与摇匀取样对检测结果的影响 直接用吸管从烧瓶中吸取1ml，测得细胞数为0.39亿个/ml，摇匀后取样测得细胞数为0.865亿个/ml，约为不摇匀时的2.2倍。可见取样均匀与否对测得结果影响重大，测时必须混合均匀。 2.3.2样品混匀的方式 2.3.2.1烧瓶内的菌液低于细颈下方，可直接混匀取样。 2.3.2.2烧瓶内的菌液液面位于细颈上方，先是采用灭菌胶塞塞口倒置反复振荡，考虑染菌机会较大，采用灭菌吸管取样时用吸管搅匀取样，效果不错。 3己酸菌液复壮种子直接用于大生产种子的过程控制与意外染菌处理 3.1在试验过程中，将试验烧瓶种子与烧瓶种子进行对比检测，凡试验种子达标而烧瓶种子不达标的直接更换种子。 3.2己酸菌种子液发黑原因的分析： 己酸菌种子由于采用连续培养，感染杂菌机会较多，种子液变暗发黑则是一个征兆，接种时必须尽是减少染菌机会，尽量避免敞口，操作注意消毒，做好无菌室紫外灯杀菌工作。化验过程中取样次数多偶尔发黑现象也是基于同样道理。对发黑种子液可采用90热处理10分钟的方法进行纯化，再于35培养710天。 3.3生产中有时种子菌数较高，但对于已出现发黑迹象者，我们必须及时进行更换，以杜绝污染源。 4己酸菌液培养过程中产气与生长的关系讨论 4.1己酸菌生长过程中主要产生氢气及CO2； 4.2己酸菌培养产气状况与细胞数的生长有一定的相关关系，一般而言，细胞数多则产气多，细胞数少则产气少。反之则不然，产气多未必细胞数多，因为培养初期种子液中有机酸与CaCO3反应产生CO2形成假象，而产气少细胞数一般都少。 4.3试验过程中采用“”、“”来记录产气多少，“”表示不产气或基本不产气，“”表示产生少量气泡，“”表示产生气泡较多或大泡小泡都有，“”表示摇动时气泡很多或不动也冒泡。 5己酸菌培养过程各影响因素测定 5.1己酸菌接种量对己酸菌生长的影响3 5.1.1不同接种量的生长状况跟踪检测数据（单位：亿个细胞/ml） 接种量1天2天3天4天5天6天7天8天9天10天11天10%0.380.6350.6750.81.011.1750.7350.7950.7250.530.3115%0.3750.831.3551.4651.4651.611.01.041.020.810.5820%0.731.451.410.8450.351.321.2450.511.60.940.575 注：接种种子细胞数为1.05亿个/ml。 5.1.2不同接种量生长曲线 5.1.3不同接种量对生长过程的影响讨论 5.1.3.1从测定数据看，10%接种量在第5、6天达高峰，15%接种量在4、5天达最高峰，而20%接种量在第2、3天即达旺盛期；从最高细胞数看，15%及20%接种量最高值达1.6亿个/ml，而10%接种量仅为1.175亿个/ml，差别较大。 5.1.3.2采用20%接种量其生长曲线出现多次波折，排除取样化验过程的误差，其原因难以一时摸清，但联系起己酸菌种子细胞数忽高忽低的现象，与接种量有时过大不无关系，因此，接种时必须计量，建议采用15%接种量。 5.2不同碳酸钙对己酸菌生长的影响 5.2.1采用分析纯碳酸钙及工业轻质碳酸钙对己酸菌生长的影响，采用15%的接种量，接入细胞数1.01亿个/ml的种子，培养6天测得分析纯CaCO3种子细胞数1.475亿个/ml，而加入工业轻质CaCO3种子细胞数为1.375亿个/ml，差别不大。 5.2.2采用不同CaCO3对硫酸铜显色试验的影响 由于工业用轻质CaCO3含杂质较多，因此加入硫酸铜溶液后蓝色显得浑浊，而加入分析纯CaCO3种子液显色试验蓝色晶莹自透澈。 5.2.3取种子液1ml，加入CuSO4溶液2ml，乙醚5ml充分振荡，静置后添加不同CaCO3的蓝色层颜色都较深，在700010000ppm左右。 5.3不同填充系数对己酸菌生长的影响 5.3.1由于己酸菌属厌氧菌，因此尽是保持厌氧状态。 采用同为1000ml的规格有差异的烧瓶，装入1L乙酸钠培养基，加入种子液100ml，小烧瓶液面在细颈中央，而大烧瓶液面未达到细颈，于35培养5天，测得小烧瓶己酸菌细胞数为1.05亿个/ml，而大烧瓶为0.931亿个/ml，充满培养基为