16 生物化学实验--醋酸纤维薄膜电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶.doc

醋酸纤维薄膜电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶 【目的】 1 掌握电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶的原理与技术。 2 熟悉测定血清乳酸脱氢酶同工酶的临床意义。 【原理】 体内 LDH 同工酶均由四个亚基组成。亚基分二种，即 “ H ” 亚基（多分布于心肌）与 “ M ” 亚基（多分布于肌肉）。根据亚基不同， LDH 同工酶分为以下五种（表 3-8 ）。 表 3-8 LDH 同工酶的分类与组成 分类 亚基组成 LDH 1 LDH 2 LDH 3 LDH 4 LDH 6 H H H H(H 4 ) H H H M(H 3 M ) H H M M(H 2 M 2 ) H M M M(HM 3 ) M M M M(M 4 ) 由于 LDH 同工酶的亚基组成不同，在 pH8.6 巴比妥缓冲液中所带电荷不同，通过醋酸纤维薄膜电泳可以将血清样品中的各种 LDH 同工酶彼此分开。 以乳酸钠（钾）为基质，在有氧化型辅酶 存在时， LDH 可是乳酸脱氢生成丙酮酸、使 NAD + 还原为 NADH+H + ， NADH+H + 又将氢传递给吩嗪二甲酯硫酸盐（ PMS ）， PMS 再将氢传递给氯化硝基四氮唑蓝（ NBT) ，使其还原为紫蓝色化合物，因此有 LDH 活性的区带即着紫色，生成颜色深浅与 LDH 活性成正比。其反应如下： 将电泳后的 醋酸纤维薄膜与含有底物乳酸和显色剂的染色液一起保温，便可显示出血清 LDH 同工酶的谱带（图 3-8 ）。将各谱带洗脱进行比色分析，即可求得各同功酶的相对百分比。 图 3-8 LDH 同工酶电泳图谱 【器材】 1 电泳仪 2 电泳槽（用二层滤纸或纱布搭桥） 3 恒温水浴 4 分光光度计 5 点样器 6 白瓷盘 7 玻璃板 8 镊子 【试剂】 1 pH8.6 巴比妥电泳缓冲液（离子强度 0.05 ） 巴比妥钠 20.6g ， 巴比妥 3.68g ， 蒸馏水加至 2 000ml 。 2 pH7.5 磷酸盐缓冲液（ 0.1M ） 磷酸二氢钾 2.16g ， 磷酸二氢钠 30.13g ， 蒸馏水加至 1 000ml 。 4 冰箱保存。 3 吩嗪二甲酯硫酸盐液 吩嗪二甲酯硫酸盐 0.5g ， 蒸馏水加至 500ml 。 4 氯化硝基四氮唑蓝液 氯化硝四氮唑蓝 1.25g ， 加入 pH7.5 的磷酸盐缓冲液至 300ml( 温水助溶过滤 ) 。 5 1M 乳酸钠液（或 0.5M 乳酸钠液） 取 70% 80% 液体乳酸钠 8ml ，加水至 200ml 为 0.5M 乳酸钠液。取 70% 80% 液体乳酸钠 16ml ，加水到 200ml 为 1M 乳酸钠液。 6 染色应用液 NAD + 40mg ， 0.1M 磷酸盐缓冲液 4ml ， 氯化硝基四氮唑蓝 12ml ， 1M 乳酸钠 4ml ， 吩嗪二甲酯硫酸盐 1.2ml ， 混合即可。临用前配制，避光保存。 7 洗脱剂 氯仿 9 份，无水乙醇 1 份，混匀。 8 固定液 10% 冰醋酸。 【操作】 1 准备 将醋纤膜浸入 pH8.6 巴比妥缓冲液中浸泡 15 20min （注意：先让膜漂浮在液面，待膜全部湿润后在将膜浸入液内）。取出后用干滤纸吸去多余的水分。 2 点样 将血清样本用小吸管吸出置于载玻片上，用点样器充分蘸满血清，然后将点样器垂直接触到膜一端 1.5cm 处，待血清全部渗入膜内，静置 2 5min （点样线应细窄均匀集中）。 3 电泳 点好血清的薄膜条放置于电泳槽滤纸桥上，糙面（点样面）朝下，点样端在阴极端，膜条与滤纸紧贴、拉直，然后盖上槽盖，平衡 5min 后即可通电。电压为 25V/cm ，通电 30 40min ，关闭电源，电泳完毕。 4 染色 在电泳结束前 10min 配制染色应用液，取未用过的 2.5cm 8cm 醋纤膜一条，使其漂浮在染色液上直到膜条完全湿透。将电泳毕的膜条自电泳槽内取出，点样面朝上贴于载玻片上。然后取出浸泡在染色液中的薄膜小心覆盖于载玻片的电泳膜上，切勿拖动，操作需迅速，避免起泡和干燥。将载玻片移置于有盖搪瓷盘内，盘内放一块湿润的纱布，以保持盘内湿度，置 37 恒温水浴箱中，保温 40min （为节省时间可在 40 温度下保温 5 10min ），在有 LDH 活性的地方即可显出紫色区带。 5 定量 将染色后的膜条置于固定液中固定 10min ，待干后将各区带剪下溶于 2ml 洗脱液中，待膜溶解、色泽浸出以后用分光光度计在 560nm 波长处以洗脱液调 “ 0 ” ，求得各管吸光度。 【计算】 血清中，某种 LDH 同工酶 占血清总 LDH 的百分比，按以下公式计算： 【注意事项】 1 红细胞内 LDH 活力比血清约高 100 倍，标本不能溶血。血清标本宜新鲜，室温下应在 24h 内做完。 2 所用器材必须绝对清洁，整个试验过程必须控制温度和时间，以求结果准确。 3 缓冲液 pH 要准确。 4 电泳时温度不宜过高。室温超过 25 时需用冰降温，以免影响酶的活力。 5 最近有一些文献报导 LDH 同工酶 H 和 M 亚基均有突变种，导致电泳图谱有五种以上区带。 6 也有文献报导人血中存在有抗 H 或抗 M 抗体，以至做同工酶分析时含 H 或 M 亚基的同工酶减少，甚至完全丧失。 7 四氮唑蓝染色反应被用来测定同工酶活力，但有种非特异的酶被称为 “ 无名脱氢酶（ Nothing dehydrogenase, 简称 NDH ）也可以产生类似反应，它干扰同工酶分析。在同工酶谱上 NDH 区带位置相当于 LDH 1 和 LDH 3 处。 8 不同方法测定正常值不同，用同一种方法测定，各家报告的结果亦略有差异。醋纤膜电泳分离血清 LDH 同工酶参考正常值见表 3-9 。 表 3-9 醋纤膜电泳分离血清 LDH 同工酶参考正常值（ % ） 作者 例数 LDH 1 LDH 2 LDH 3 LDH 4 LDH 5 上海闸北中心医院 福州军区总医院 40 39 23 34 18 33 35 44 28 40 19 27 18 30 0 5 6 16 0 12 2 3 9 临床意义 在不同的组织中 LDH 同工酶谱是不同的（表 3-10 ），因此，器官损害可以在血清 LDH 同工酶谱中反映出来。 LDH 同工酶测定目前主要应用于协助心肌梗塞和某些肝脏疾病的诊断。在心肌梗塞时 LDH 1 增加， LDH 2 /LDH 1 的比率低于 1 。 血清 LDH 5 增加者可以做为急性肝炎早期指征，且可以在黄疸出现之前。持续升高或继续增加提示有慢性肝炎。肝癌 LDH 5 增加，胆汁性梗阻时 LDH 4 和 LDH 5 均增加，升高最多的是 LDH 4 。 骨骼肌损害，血清中 LDH 5 增高，创伤之后也有短暂升高，如臀部骨折及广泛性的外科手术后。 此外，活动性风湿性心肌炎，急性病毒性心肌炎、恶性贫血、获得性溶血性贫血、淋巴瘤和白血病（伴有溶血性贫血）时， LDH 4 均增高。充血性心力衰竭（代偿失调）、坏死性肝硬化、肝内肿瘤转移等， LDH 5 增加。 表 3-10 人体组织中 LDH 同工酶的分布 组 织 LDH 同工酶活性 LDH 1 LDH 2 LDH 3 LDH 4 LDH 5 心 脏 73 24 3 0 0 肝 脏 4