大肠杆菌药敏试验简易方法.doc

大肠杆菌药敏试验简易方法近年来，随着养鸡业的迅猛发展，鸡大肠杆菌病的发病率和死亡率也不断增加，现已成为危害养鸡业（特别是肉鸡）最为重要的疾病之一，为细菌病之首。因此，广大养鸡户谈之色变，没有比感染病毒病又继发大肠杆菌病更糟糕的了。正因为如此，抗生素得到了大量广泛的应用，又由于大肠杆菌对抗生素容易产生耐药性，所以大肠杆菌的耐药性问题日益突出。如何解决这个问题将是畜牧兽医工作者今后工作的重点。而就目前来说，通过抗菌药物敏感性试验（药敏试验）选择敏感药物对鸡群进行预防和治疗是降低大肠杆菌病发病率和死亡率的有效手段。标准的药敏试验（纸片扩散法）比较繁琐，要先进行细菌培养，再进行药敏试验，试验设备要求高，基层兽医诊疗机构很难做到，现介绍一种简易药敏试验方法（纸片扩散法1）。1试验方法和步骤1.1试验设备恒温培养箱1台、干燥灭菌箱1台、酒精灯1个、接种棒（带接种环）1个（接种环可用回形针自制）、手术剪1把、镊子1个、普通营养琼脂1瓶、玻璃平皿（直径90mm）数个、烧杯（500ml）1个、玻璃棒1个、普通电炉1台、定性滤纸1盒、 蒸馏水适量、生理盐水适量、小玻璃瓶（如链霉素瓶）数个（洗净晾干）、钢笔1支、细针头数个、高压蒸汽灭菌锅（可选）1个、普通天平1台、药勺1个、尺子1个。1.2普通营养琼脂平皿制备1.2.1平皿消毒将玻璃平皿洗净，晾干。用干燥灭菌箱120灭菌1小时；也可用酒精灯火焰消毒，将玻璃平皿内壁靠近火焰，同时慢慢转动平皿使之均匀受热，待平皿内壁上水珠烤干并发烫为止。1.2.2琼脂消毒营养琼脂与蒸馏水（或生理盐水）以3g：100ml的比例加入烧杯（先加蒸馏水，后加营养琼脂），用电炉加热同时用玻璃棒搅拌，使营养琼脂溶化均匀。如有高压蒸汽灭菌锅可将溶化的琼脂液装入生理盐水瓶中（不超过其容量的2/3），瓶口留一通气孔（一般用16号 针头刺入瓶盖），将瓶站立放入锅内，加热至121保持15分钟即可；如无高压锅可直接用电炉加热至沸腾后立即将烧杯从炉上拿下来，待泡沫消了，再放到炉上，如此煮约20分钟（煮时不断搅拌）。1.2.3琼脂导入与保存将消毒好的琼脂趁热通过玻璃棒引入平皿（也可直接倒入平皿），每皿约需2025ml琼脂液，琼脂厚度约34mm，倒完盖上平皿，凉透放入冰箱（28）备用，一般保存不超过1周。1.3药敏片制备简易方法是将滤纸片用打孔器或剪刀剪成小圆形（直径约6mm）或小正方形，用干燥灭菌箱灭菌备用。将适量药物放入小玻璃瓶中，用少量无菌蒸馏水（注射用水）溶解稀释（液态药物不稀释），然后放入滤纸片并浸湿，再将小瓶中多余的药液沥净，瓶壁贴上写有药名及批号的标签，然后将小瓶放入恒温箱（37）烘干备用。1.4接种病原由于大肠杆菌在普通培养基上生长良好，且病死鸡内脏大肠杆菌含菌量很高，因此可以直接用接种环蘸取病死鸡内脏组织（肝、心包、气囊等），然后均匀涂布于琼脂表面，但注意不要划破琼脂。然后在平皿底壁中心及四周用钢笔写上药物名称（一般一个平皿做五种药物），再用细针头蘸取药片贴到琼脂上（与所写药名的位置对应），最后放入恒温箱37培养1820小时观察结果。1.5结果判定抑菌圈直径与药物敏感性关系见表1、表2。表1简易药敏试验结果 抑菌圈直径（mm）敏感性30极敏感2030高敏感1519中敏感15低敏感0不敏感 表2标准药敏试验结果2 抑菌圈直径（mm）敏感性20极敏感1520高敏感1014中敏感10低敏感0不敏感2与标准方法不同点2.1消毒方法平皿、烧杯等玻璃器皿可用酒精灯火焰消毒。2.2琼脂浓度琼脂粉与蒸馏水（或生理盐水）的比例可适当小些（3g：100ml）。2.3平皿制作制作琼脂平皿时，如没有高压蒸汽灭菌锅，可直接将琼脂液煮沸消毒（约20分钟），煮沸不能使琼脂液完全无菌（细菌芽孢仍可存活），但因所涂病变组织含菌量高，增殖快，即使平皿上有少量细菌芽孢（繁殖慢）也不会影响结果。做好的平皿要检查灭菌效果，可任选一平皿放恒温箱培养24h，如无可见菌落生长则合格，否则应全部丢弃。2.4病原接种因病死鸡（有“三炎”病变）内脏大肠杆菌含菌量高，因此可以省略细菌培养一步，直接蘸取病死鸡内脏组织均匀涂布于琼脂表面。2.5药敏片制作抗大肠杆菌药多为复方制剂，因此使用哪个厂家的药就应用此药做药敏片，药粉可不按要求稀释只要能溶化即可，但要保证所选药物质量过关，药中成分含量足，所标量即为治疗量。3判定结果时抑菌圈直径偏大原因3.1药物浓度 由于本试验药敏片制作是直接将滤纸片浸入液态药物或药粉溶化后的溶液，药物未按标准稀释，浓度高，所以抑菌圈一般偏大。3.2琼脂浓度 琼脂制作时琼脂液浓度比生产商推荐的浓度（4.4g：100ml）低。目的是为了增加琼脂的湿度，防止琼脂表面过于干燥不利于病料均匀的涂布，同时由于浓度降低提高了琼脂的透明度，有利于结果的观察。但由于琼脂浓度降低会加快药物扩散因此抑菌圈直径也会偏大。4药物选择方法4.1一般原则优先选择抑菌圈大的，口服吸收好的药物，其他作为备用药品。4.2药物扩散性一般情况下水剂药物抑菌圈大于粉剂，扩散性好的药物（如水剂药物）的抑菌圈大于扩散性差的药物（如粘杆菌素、安普霉素等），因此有些药物如以含粘杆菌素、安普霉素、利福霉素等为主的复方制剂在药敏试验中如果抑菌圈大于25mm应判为极敏，2025mm判为高敏。4.3其它情况药物使用时，有些药物的抑菌圈较大但圈内有细菌生长，说明有一部分细菌不能抑制，这时可选没有杂菌的；如果其他药物抑菌圈太小，可使用带有杂菌的药物并配合使用一种抑菌圈相对较大的药物。5影响药敏试验结果的因素药敏试验结果主要指抑菌圈的大小，影响抑菌圈大小的主要因素包括：培养基（营养琼脂）的质量、浓度、厚度、pH值；药敏片的药物浓度、pH值；细菌接种量等。5.1培养基 培养基应选择质量有保证的生产厂家，琼脂的浓度和厚度可参照本试验。5.2药敏片药物浓度本试验中自制药敏片的药物浓度近似于原药浓度。由于基层设备条件等限制，对商品药按说明进行准确稀释不易做到，容易出现误差，同时也很麻烦并易污染细菌。因此可采用液态药物不稀释，粉状药物加少量蒸馏水稀释的方法制作药敏片，经过近几年的临床试验表明本方法除了能引起抑菌圈偏大之外，未见其他明显差别。5.3药敏片pH值由于自制药敏片中药物浓度高，酸、碱性可能较强，pH值范围相对较广，多数药物的pH值在58之间，可能抑制某些细菌的生长，但由于大肠杆菌的生长繁殖对环境要求不高，其生长pH值为583，所以药敏片的pH值对本试验影响很小。5.4细菌接种量本试验接种病原采用直接蘸取涂布的方法，省略了细菌培养和菌液培养。由于条件限制，基层部门如果进行繁琐的培养过程，容易引起污染造成结果不准确，同时，感染大肠杆菌的新鲜病死鸡或濒临死亡的鸡内脏大肠杆菌含量较高，如果每次蘸取内脏的次数相等且涂布均匀，那么每次药敏试验的细菌接种量可认为近似相等。5.5其他测定磺胺类药物时，应选用无蛋白胨琼脂平皿，因为蛋白胨能使磺胺药失去作用4。6小结简易药敏试验是在标准药敏试验（纸片扩散法）的基础上，对一些步骤进行简化、调整之后的方法，主要应用于防治鸡大肠杆菌病时敏感药物的选择。因其具有简单和易操作性，且临床效果良好，故而适合技术设备条件较薄弱的基层兽医诊疗部门使用和推广。 补充：此法仅限于粗略检测。（100g200KG这是一般成品兽药的兑水规格。实际上做的药敏片中的药物浓度为100g20KG（浓缩十倍，其它兑水规格也如此）也就是100g放入到20 000ml水即可。实际操作的时候用天平或者精密电子称称取1g药品加