伯氏疏螺旋体外膜蛋白C基因在大肠杆菌中的表达.doc

伯氏疏螺旋体外膜蛋白C基因在大肠杆菌中的表达伯氏疏螺旋体外膜蛋白C基因在大肠杆菌中的表达2010-09-05 佟玉品毕胜利冯方波贾月萍 【摘要】目的体外表达伯氏疏螺旋体外膜蛋白C(OspC)，以制备基因工程重组抗原用于莱姆病血清学诊断研究。方法应用聚合酶链反应技术和基因重组技术，从2个伯氏疏螺旋体中国分离株基因组DNA中扩增得到OspC基因，分别克隆到表达载体LKB2中，在大肠杆菌中进行表达。结果以天然蛋白形式高效表达了OspC。扫描分析显示，表达的OspC相对分子质量均在23 000左右，表达量占菌体总蛋白的34%50%。Western blot试验证明，重组OspC蛋白可与莱姆病患者血清发生特异性反应。结论重组OspC的成功表达为制备新型莱姆病早期诊断试剂奠定了基础。 【关键词】伯氏疏螺旋体外膜蛋白基因表达聚合酶链反应 Expression of outer surface protein C of Borrelia burgdorferi in Escherichia coli TONG Yupin, BI Shengli, FENG Fangbo, et al. Department of Experimental Medicine, 261st Hospital of PLA. Beijing 100094 【Abstract】ObjectiveIn order to express outer surface protein C(OspC) of Borrelia burgdorferi in vitro and make research on the serodiagnosis of Lime disease with recombinant protein. MethodsOspC gene, amplified from two Chinese isolates of Borrelia burgdorferi, were cloned into an expression vector LKB2 respectively. Two expressed vectors BT-OspC and BJ-OspC were constructed and then expressed in E.coli. ResultsOspC proteins were expressed heavily in a nonfused form which weighted 23 000 and accounted for 34%50% of total bacterial protein. Western blot analysis showed that the expressed protein could be specifically recognized by the sera from patients with Lyme disease. ConclusionThe successful expression of recombinant OspC protein makes a foundation for developing early diagnostic agents for Lyme disease. 【Key words】Borrelia burgdorferiOuter membrane proteinGene expressionPolymerase chain reaction 莱姆病是一种蜱媒疫源性疾病，在某些地区及特殊群体中感染率及发病率较高1。但目前国内尚缺少敏感、特异的诊断方法，以做到早期诊断、及时治疗。伯氏疏螺旋体(Borrelia Burgdorferi)是莱姆病的致病病原体，其外膜蛋白有较强的抗原性，国外研究报道，外膜蛋白C(OspC)具有很强的免疫原性，机体在感染早期可产生特异性IgM抗体，应用纯化抗原免疫动物，在实验动物感染后很短时间即可检测到高滴度的IgM抗体，重组OspC已用于莱姆病的血清学诊断2，3。为了进一步研究伯氏疏螺旋体中国分离株OspC的免疫原性，我们从2个国内分离株中扩增出OspC基因，插入表达载体LKB2，并在大肠杆菌中进行表达，以期制备基因工程重组抗原，应用于伯氏疏螺旋体OspC的抗原性和免疫原性研究及莱姆病的早期血清学诊断。 材料与方法 一、菌株培养及基因组DNA制备 伯氏疏螺旋体分离株BT01为北京西山地区长角血蜱分离株，BJ-9011为一莱姆病患者血液分离株4，5。均由本室保存并在BSK培养基中培养，其基因组DNA制备按常规方法进行。 二、血清标本 莱姆病IgM、IgG抗体阳性血清均来自北京军区某团战士，经临床诊断及IFA检测证实。 三、质粒和菌种 表达质粒LKB2和宿主菌BL21(DE3)由中国预防医学科学院病毒学研究所肝炎室提供。 四、引物和主要试剂 聚合酶链反应(PCR)引物参照文献6，PKo株基因序列自行设计，上游引物：5GCGCCATGAATAATTCAGGGA3，下游引物：5TTAAGGTTTTTTTGGAC3由中国科学院微生物研究所合成。扩增片断为除信号肽外的OspC基因，长度约582bp。限制性内切酶、T4DNA连接酶、Klenow酶等购自Biolab公司，dNTP、Taq DNA聚合酶为Promega公司产品，其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。 五、OspC基因克隆 PCR方法及扩增产物鉴定参照文献7进行，扩增产物Klenow酶补平后用DEAE-纤维素膜电泳回收法回收，再经NcoI酶切处理。同时将质粒载体LKB2进行NcoI和SmaI双酶切，回收。T4DNA连接酶连接PCR产物和载体，转化大肠杆菌BL21，经NcoI和ClaI双酶切鉴定阳性克隆。 六、OspC基因在大肠杆菌中的表达及表达蛋白SDS-PAGE分析 将酶切鉴定阳性的重组质粒BT-OspC和BJ-OspC分别转化宿主菌BL21，挑选单斑活化至A600约0.6，加入异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)，其诱导浓度为1mM，37诱导3小时，收集菌体，离心弃上清，细菌沉淀用12.5%SDS-PAGE电泳检测。并用日本Shimadzu产CS-9301PC型薄层扫描仪分析表达蛋白大小及含量。 七、免疫印迹(Western blot)分析 以空载体的转化菌作对照，用12.5%SDS-PAGE电泳分析两表达质粒，将凝胶分成相同两份，分别进行考马斯亮蓝染色和免疫印迹试验。Western blot方法如下：通过电转仪将凝胶上蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，电转条件为100V，200mA转印1.5小时。以20%小牛血清室温封闭2小时，洗涤，将膜转入1100稀释的莱姆病IgM抗体阳性患者血清，37反应1小时，洗涤后，将膜转入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgM中，室温反应2小时，以底物4氯-1-萘酚(4CN)和0.01%过氧化氢溶液显色1020分钟，用去离子水漂洗以终止反应。 结果 一、PCR扩增产物分析及重组质粒的鉴定 通过PCR反应两株螺旋体皆扩增出580bp左右的DNA片段，与预期实验结果一致。重组质粒BT-OspC和BJ-OspC经内切酶NcoI和ClaI酶切，也都能切下一920bp左右的DNA带(载体LKB2中NcoI和ClaI酶切位点之间为335bp)，表明PCR结果及重组质粒酶切分析与设计相符。 二、重组OspC蛋白表达和免疫印迹分析 经挑选的表达