微滴数字PCR.doc

微滴数字PCR Bio-Rad与QX100 dPCR技术继续发展，形成了ddPCR技术。这就是QuantaLife公司开发出的微滴数字PCR技术。该产品还获得了2011年度Frost & Sullivan北美新产品创新奖。2011年10月，Bio-Rad公司收购了QuantaLife和ddPCR技术，推出了QX100微滴式数字PCR系统。与Fluidigm和Life Technologies不同，Bio-Rad对样品进行微滴化处理。据该公司基因表达部门的销售经理Richard Kurtz介绍，他们的独特优势是能够产生非常均一、重复的1纳升液滴。这样的好处是每个样品形成20,000个液滴，而其他系统只能分成760-3,000个部分。分得越多，则意味着分析越准确。 QX100微滴发生器（droplet generator）将含有核酸分子的反应体系形成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子，且每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。经PCR扩增后，采用微滴分析仪（droplet reader）逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。对于QX100系统，每个液滴能容纳最多5个目标，这是因为它们能分得更多；这带来了更广的动态检测范围。据介绍，QX100可处理1-100,000个拷贝的样品，而无需在运行之前进行连续稀释。 Bio-Rad公司去年底曾在Analytical Chemistry杂志上发表文章，证明了QX100微滴式数字PCR系统在三个方面的作用：拷贝数变异（CNV）研究、稀有等位基因检测和血浆DNA定量。对于CNV研究，大量的微滴提供了足够的精确度，能准确测定拷贝数状态。利用QX100微滴式数字PCR系统来筛查HapMap样品的CNV，拷贝数状态可完全分辨。对于稀有等位基因的检测，将突变DNA与高度同源的野生型DNA分开，提高了灵敏度。有了QX100系统，研究人员能够检测BRAF V600E中低至0.001%的突变片段，与定量PCR相比，灵敏度提高1000倍。最后，研究人员还利用微滴式数字PCR技术准确检测了孕妇血浆中高度片段化的DNA，这有望应用于无创产前诊断。微滴数字PCR的数学原理-泊松分布1. 定义： 基因拷贝数：c（copy），一个拷贝代表一个独立的目的DNA片段 生成微滴数：d（droplets） 定义这样一个事件X：对于某指定微滴，某一个目的DNA片段对是否进入此微滴进行一次选择。那么发生进入事件的概率是p =1/d。2. 对于某一特定微滴，发生N次X事件，进入了k个目的DNA片段的概率是：（1）这是一个二项分布。注意这里的N = c, 有c个目的片段，就会发生c次这样的X事件。3. 泊松分布：当二项分布的N很大而p很小时，泊松分布可作为二项分布的近似（）： （2）其中为N p = c/d, c/d 即每个微滴中的平均拷贝数。所以要使用泊松分布来计算，我们必须满足两个条件：ap = 1/d要小，即是说划分要够细，即微滴数（d）要够多，越多则计算越准确。bN = c要大。如果c太少我们就要把计算方法还原到二项分布（见5）。4. 在实验过程中，我们可测量的就是阳性率q。则阴性率为1-q，即没有任何分子进入的微滴的比率，代入（2）式：1-q = P（x = 0）= e-， = c/d。则= c/d = - ln（1-q），（3）而每个微滴的体积是一定的（假定为1 nl），则我们可以推断出目的基因的拷贝数为 1000* - ln（1-q） copies/ul .5. 当c很小时，使用公式（1）计算： 1- q= P（x = 0）= （1 p）c 而p =1/d很小，则用泰勒展开得近似式：1- q = 1 c/d c/d = q, 此时如用（3）式计算，因为阳性率同样极