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生物测定技术期中作业姓名：董丽萍学号：2009090324日期：2009年5月20号杀虫剂生物测定技术的研究进展董丽萍（植物保护学院 650201 昆明）摘要：杀虫剂的生物测定是利用昆虫、螨类对杀虫剂的反应，来鉴别某一种农药或化合物的生物活性。是测定农药对昆虫、螨类毒力与药效的一种基本方法。本文介绍了杀虫剂生物测定技术的主要内容、基本原理和主要方法。关键词：杀虫剂；生物测定；主要内容；基本原理；主要方法Insecticide Bioassay Research ProgressDONG Li-ping(Plant Protection Institute, Yunnan Agricultural University，Kunming 650201)Abstract: Biometrics is the use of pesticides, insects, mites response to pesticides, to identify a particular pesticide or a compound of biological activity. Is the determination of pesticides on insects, mites toxicity and efficacy of a basic method. This article describes the main pesticide content of biometric technology, basic principles and main methods.Key words: pesticides; bioassay; main content; basic principles; the main method随着农药科学的发展，生物测定技术显得更加重要。为了科学合理的使用农药，改善和提高防治病虫害等有害生物的技术，加快发展高效安全、经济的农药品种，不断的从应用实践中总结化学保护，以及开展毒力学基础等方面的研究，生物测定技术是重要的先决条件，它的地位和作用随着农药的发展而不断得到加强和提高。杀虫剂生物测定的基本原理是利用昆虫、螨类、温血动物对药剂的反应来鉴别杀虫剂的毒力和药效。主要内容分为：初步的毒力试验；精密的毒力测定。主要方法包括杀虫剂室内毒力测定方法：喷粉喷雾法、浸渍法、食料混合法；杀虫剂毒杀作用的测定方式：胃毒作用测定技术、触杀作用测定技术、杀虫剂内吸毒力的测定、杀虫剂熏蒸毒力测定 、昆虫特异性控制剂的生物测定、昆虫拒食活性的测定 、忌避活性测定、杀卵作用的测定；近年来发展的测定方法 ：杀虫剂细胞生测体系、分子及细胞组织水平的筛选模式、基因芯片等。1 杀虫剂生物测定的主要内容1.1 初步的毒力试验主要用于大量新化合物的杀虫活性筛选，明确供测试化合物的生物活性，淘汰无杀虫活性或活性低的化合物，选出活性高，认为有希望的化合物进一步做精密的毒力试验。用于田间防治害虫筛选有效药剂。初步的毒力试验一般每处理用试虫20-50头。重复2-3次，以测定浓度和对应的死亡率或虫口减退率作为评价化合物活性大小或作用效果的标准。1.2 精密的毒力测定是在特定的条件下衡量某种杀虫剂对某种昆虫的毒力程度的一种方法。精密测定的作用：了解某一种杀虫剂对某一种害虫的毒力程度；比较几种杀虫剂对某一种昆虫的毒力差别。它是研究昆虫毒理学的基本内容之一，也为田间害虫防治选择农药品种、药量、使用方法等提供依据。1.3 应用生物统计的方法分析试验结果杀虫剂的生物测定影响因素诸多，动物本身的因素如受试动物的性别、年龄、体重；实验条件如温度、湿度、器械；实验者因素如观察指标、操作方式等。即使是同一操作者在同一条件下因受试动物本身个体差异的影响，其试验结果仍有一定差别。因此，合理的使用生物统计具有重要意义1。对试验结果用生物统计工具进行比较和分析，对于消除试验误差，了解错综复杂的大量数据之间地内在规律，揭示供试化合物与靶标之间的内在关系等非常重要。尤其是目前计算机的普及和许多生物测定统计软件的应用，使得生物测定试验的统计分析、数据处理和保存更加方便快捷。2 杀虫剂室内毒力测定方法2.1 喷粉喷雾法基本原理是使杀虫剂附着于虫体表面，通过表皮侵入昆虫体内致毒。同时，药剂亦可从气门进入虫体，仍属于一种对昆虫作用全面的方法。此法是利用特殊的喷粉装置进行施药的。Potter喷雾塔、ZB-2A型沉降塔、真空喷粉器。2.2 浸渍法浸渍法2-4作为触杀作用的测定方法之一，因为方法简单快速，不需要特殊的仪器设备，常用于有效化合物的筛选试验，被联合国粮农组织（FAO）推荐为蚜虫抗药性的标准测定方法。具体方法因试虫种类而异。2.2.1 直接浸虫法将试虫直接浸入药液中（如粘虫、菜青虫、小菜蛾等），浸液一定的时间后取出晾干，或用吸水纸吸去多余的药液，再移入干净的皿中放入新鲜饲料，置于合适的温湿度及通气良好的环境中，隔一定时间（5h、24h或48h）观察记载试虫死亡情况，计算死亡率（或校正死亡率）求得致死中浓度。2.2.2 连同附有试虫的植物浸渍法连同附有试虫的植物浸入药液中（如蚜虫、斑潜蝇等），浸液一定时间（3-5s）后取出用吸水纸吸去叶缘液滴，记录试虫数，茎基部插入保湿海绵上，置于合适的温湿度及通风良好的环境中，隔一定时间（24h或48h）调查活虫数，计算减退率。求回归式或LC50。2.2.3 浸载玻片法 此方法被联合国粮农组织推荐为螨类抗药性的标准测定方法。将双面胶带剪成2cm长，贴在载玻片一端，然后用镊子夹取胶带上的纸片，选健康的3-5d龄的雌成螨，用毛笔挑取雌成螨并将其背部粘在粘胶带上（足、触须、口器不要被粘着），每片20-30头。然后放在干净无毒的皿内，其中放一湿棉球保湿，盖上盒盖，置于20-30，经4h后，用解剖镜检查，如有死亡个体弃掉，重新贴上健康的雌螨。然后将贴有试虫的载玻片浸入药液中，并轻轻摇动玻片，浸5s后取出，用吸水纸吸去多余的药液，然后放入干净的皿内，置于27下培养，24h后，检查死亡数及存活数。死亡标准以毛笔轻轻触动螨的足或口器，无任何反应即为死亡。2.2.4 MI生测法 微量浸渍生测法是在浸载玻片法上改进的对螨类的测定方法。用收集和处理螨类的装置在双目解剖镜下，25头成螨在足够的空间下从被害的叶片上被吸入，剔除一些不活泼和受损的个体。把收集和处理装置卸下，装到一个GilsonP 100吸管上。将GilsonP 100吸管直插入药液中浸渍30s ,在前20s内轻轻敲打管除去气泡，增加药剂与螨体的接触。30 s后取出吸管将螨置于培养室培养，观察死亡率。2.3 食料混合法此法适用于储粮害虫、家蝇、蜚蠊等。即将一定量的药液或药粉与试虫食料充分混匀成一定浓度的饵料，再接入一定数量的供试昆虫，任其接触取食，定期观察效果。上述方法是比较粗放的初步毒力测定技术（或叫初筛试验），它只能判断药剂是否有毒，不能区别药剂的毒杀作用方式。但是，当某种杀虫剂经过初步筛选后，其毒力接近标准药剂时，就有价值进一步测定其对昆虫的毒杀作用方式。3 杀虫剂毒杀作用的测定方式3.1 胃毒作用测定技术原理是使杀虫剂随食物一起被目标昆虫吞食进入消化道而发挥毒杀作用，尽量避免药剂与昆虫体壁接触而产生毒杀作用。 目标昆虫可以吞食含有药剂的固体食物或药液，根据目标昆虫取食的差异可分为无限量取食和定量取食法。3.1.1无限量取食 即是目标昆虫可以无限量取食混有杀虫剂的饲料，不计算目标昆虫实际吞食的药量。此法简单，但不能避免其它毒杀作用的影响。具体的饲喂方法有：饲料混药喂虫法、培养基混药法、土壤混药法 。 3.1.2 定量取食 是使目标昆虫按预定杀虫剂的剂量取食后准确测定目标昆虫吞食药剂的剂量。（1）叶片夹毒法：适于植物性、取食量大的咀嚼式口器的昆虫。具体方法包括：夹毒叶片的制备；饲喂方法；结果检查；致死中量的计算。（2）液滴饲喂法：对于舔吸式口器昆虫不宜用夹毒叶片法，如家蝇、果蝇、蜜蜂等喜食糖液，可以将一定的杀虫剂加入糖液中，用微量注射器形成一定大小的液滴（0.001-0.01 ml），直接饲喂试虫。3.2 触杀作用测定技术药剂是通过昆虫体壁进入虫体体内造成昆虫致死的，称为触杀毒力。在测定触杀毒力时，应该尽量的避免药剂可从昆虫的口器或气门进入虫体。3.2.1 微量点滴法将一定浓度的药剂点滴于虫体的某一部位，溶剂挥发后仍在体壁形成药膜而侵入虫体。此方法是测定杀虫剂触杀毒力最常用的方法，是普遍采用的一种测定技术，除螨类小型昆虫外，可应用于大多数目标昆虫的触杀毒力测定。3.2.2 药膜接触法 是将一定量的药剂采用浸沾、点滴、喷洒等方式施于物体表面上，形成一层均匀的药膜，然后接入一定数量的供试昆虫，让其爬行一定时间（4-24h）后，检查击到数或死亡率，求出药剂对试虫的毒力。用KD50或LD50表示。目前国内常用的形成药膜的方法有滤纸片法和容器药膜法。药膜法虽然能简便快速测定农药对中的毒力，但不能有效地评价内吸性农药的毒力，因此还需要发展一种能有效测定和评价内吸性药剂的生测方法5。3.3 杀虫剂内吸毒力的测定内吸杀虫剂通过植物的根、茎、叶等部位吸收到植物体内，随着植物体液输导，当害虫取食植物或刺吸汁液时，药剂随着食物进入虫体而杀死害虫。具体的测定方法有：1根系内吸法：将药剂定量加入溶液或分散于培养液或混于土壤中，使植物根部吸收，以测定在叶片上取食试虫的死亡率。2叶部内吸法：主要测定杀虫剂在植物体内的横向传导作用。（1）部分叶片施药和全面施药： 利用盆栽植物，用浸蘸法或喷雾法处理标记的部分植物叶片，经过一段时间，采摘未施药部位的叶片饲喂试虫，或在药剂处理后向未施药部位接虫以观察药效，计算出内吸毒力。（2）叶片局部施药：此法适用于测定药剂的内渗作用。将药剂喷布或涂刷于叶正面或反面，经过一段时间将叶剪下，平铺于培养皿内或瓷盘内，用湿棉球将叶柄保湿，在未涂药的一面接上蚜虫或红蜘蛛，用蒙有尼龙纱的磨口玻璃管罩住，并设空白对照，经24h或48h检查死虫数，并计算内吸毒力。（3）叶柄施药： 在叶柄上涂抹一定量药剂，在叶片上接虫，或经吸收后摘下叶片饲喂试虫，测定其对试虫或螨类的毒效。3茎部内吸法： 用毛笔将药剂定量涂抹到茎部的一定部位，并且限制长度与面积，经过一段时间在叶片上接虫或取叶喂试虫，以测定药剂的内吸杀虫作用。4种子内吸法： 用药剂浸种法或拌种法使药剂附着在种子上，将种子播入土中，随着种子吸收水分而吸收药剂。待幼苗长出以后，在其上接虫或采回叶片饲喂试虫，以测定药剂的内吸杀虫作用。 3.4 杀虫剂熏蒸毒力测定 测定杀虫剂从气孔或气门进入呼吸道系统而引起试虫中毒致死的熏蒸毒力。熏蒸毒力测定的目的主要有两个，一个是杀虫剂有无熏蒸作用，二是测定熏蒸的杀虫毒力。 3.4.1 熏蒸杀虫作用的测定 （1）二重皿法：取直径相同的磨口培养皿,皿底放入定量的供试药剂，用纱布或纱网盖住，防止试虫接触药剂。其上放试虫（玉米象、杂拟药液谷盗等）20-30头，盖上皿盖。每一药剂重复三次，对照组不加药。置25下，经24h或48 h检查结果。用校正死亡率判断药剂的熏蒸杀虫作用。（2）三角瓶法：以500mL三角瓶作容器，软木塞或弹性强的胶塞为瓶塞，以保持瓶内密封。将试虫（玉米象、杂拟谷盗）等装入带盖的小钢丝笼或布袋中。用微量注射器吸取药液（丙酮液稀释）5L，点滴于22cm滤纸片上，并迅速投入三角瓶中，封口。对照组的滤纸只加5L丙酮。在25恒温室内经24h或48h检查结果。（3）干燥器法：取大小一致的干燥器数个打开盖子，用量筒装入清水至满，测的容积，同法测的干燥器盖的容积，两者之和为干燥器的容积，倒去水烘干备用。使用之前将干燥器磨口边缘用凡士林涂抹，起密封作用。将试虫分别装入数个（5-10个）小指形管内，每管10头，管口用双层纱布及橡皮筋扎紧，置于干燥器内有孔的磁板上。将一定量的药剂投入干燥器底部立即加盖。置25恒温箱内，24h或48h检查结果。3.5 杀虫剂熏蒸毒力测定 测定杀虫剂从气孔或气门进入呼吸道系统而引起试虫中毒致死的熏蒸毒力。熏蒸毒力测定的目的主要有两个，一个是杀虫剂有无熏蒸作用，二是测定熏蒸的杀虫毒力。 3.6 昆虫特异性控制剂的生物测定3.6.1 保幼激素及其类似物的活性测定 保幼激素类似物作为杀虫剂的一个基本概念，就是选择昆虫在正常情况下不分泌或极少分泌保幼激素的发育阶段（如幼虫末龄和蛹期）中使用过量的保幼激素或类似物，抑制昆虫的变态或蜕皮，影响昆虫的生殖或滞育，甚至造成昆虫各阶段的死亡。基于这一基本概念，国内外常用的测定方法有点滴法、注射法和蜡封法。这3种方法都采用大蜡螟、大菜粉蝶的蛹，美洲脊胸长蝽、长红猎蝽若虫为试虫，特别是黄粉虫蛹是最广泛采用的标准试虫。活性测定方法有（1）点滴法（局部施药）：方法同触杀杀虫剂的微量点滴法；（2）注射法；（3）蜡封法。3.6.2 抗蜕皮激素（几丁质合成抑制剂）活性测定灭幼脲类化合物，其作用机制是抑制或干扰昆虫的蜕皮过程，抑制几丁质合成，因此又称为抗蜕皮激素。（1）离体测定：Mayer等人研究抑制昆虫几丁质合成的方法可用来测定抗蜕皮激素的活性。离体法操作比较烦琐，并且需要一定的仪器设备，但该法的测定周期性短，适用于室内大量样品的筛选。 缺点是生物测定结果和抗蜕皮激素的实际应用相差甚远，在离体下具有高活性的化合物，在活体条件下未必具有较高的抗蜕皮激素活性。(2)活体的测定：这类化合物的活体活性测定，可采用一般的胃毒或触杀毒力的测定方法进行。（3）几丁质酶抑制活性测定法 ：用于大分子昆虫几丁质酶抑制剂的筛选和活性鉴定。 3.6.3 性诱剂的活性测定有引诱作用的化学物质，在自然界中多为能产生气味而弥散空间的有机物，一般分为三类：（1）食物引诱；（2）产卵引诱；（3）信息引诱（昆虫的外分泌物，引起同种个体的异常反应）。性诱活性测定法分为两类，即昆虫行为法和触角电位法。测定方法分为（1）昆虫行为测定法：室内测定昆虫对性诱剂作出的行为反应，尽管不同种类的昆虫对性诱剂的反应细节不同，但基本上都会有如下的反应：雄虫受性诱剂分子所刺激，从静止状态转为兴奋状态，表现为摇动，张翅振动，飞翔，寻找刺激源。达到刺激源后，伸出报握器，做出交尾行为。（2）触角电位法（EAGS）： 触角电位法装置由刺激源，电位显示和记录三部分组成，当外激素分子接触触角时，触角的感受细胞在短暂的瞬间发生电位差，触角电位就是这种变化的总和，以此来判断有无引诱效果。此法一般用于测定性外激素。（3）嗅觉计（引诱剂）：是让昆虫在两个可选择的分叉处，选择向有引诱气味的分叉方向移动，凡进入有引诱剂分叉的昆虫比另一分叉显著地多时，则表现有引诱作用。3.7 昆虫拒食活性的测定 拒食剂活性：利用抑制昆虫取食的办法来控制害虫的危害。昆虫的嗜食性基本上是由位于昆虫触角、下颚须、下唇须上的感化器所以决定的，感化器将食物的特性转化成电信号传入中枢神经，从而决定取食与否。拒食剂的作用正是干扰这些感化器的正常功能。测定方法分为（1）目测法：用于咀嚼口器昆虫，如鳞翅目昆虫幼虫作试虫；（2）叶碟法：适用于食量较大的食叶咀嚼式口器昆虫的测定；（3）栖息法：用于刺吸式口器昆虫的测定；（4）电信号法测定试虫取食及拒食活性：适用于刺吸式口器昆虫拒食活性和取食行为的研究；（5）体重法：对于能用人工饲料或半人工饲料饲养的昆虫，或不宜用叶碟法测定的钻蛀性害虫（如玉米螟、二化螟），则可用体重法测定拒食活性。3.7 忌避活性测定 是指能使昆虫从分布有某些化学物质的场所避开的生物活性，也是一种用于天然产物活性评价的筛选方法。忌避剂活性的测定方法主要采用选择着落（或选择栖息）法。3.8 杀卵作用的测定 通过药剂与卵接触，来判断其对卵毒力的杀虫剂生物测定。按照接触药剂的方式可分为：1浸卵法：将卵放在叶片或滤纸上，放进药剂稀释液中浸3-5s。待药液干后，置于正常条件下孵化，观察和记录孵化情况。2药剂稀释液定量喷洒在虫卵上：将药剂稀释液定量喷洒在虫卵上。经以上两种方法处理的虫卵，待药液干后，置于正常条件下孵化，观察和记录孵化情况。3熏蒸法： 二重皿法。经过一定的时间，取出虫卵放到正常的饲养条件下孵化。3.9 近年来发展的测定方法 1杀虫剂细胞生测体系：MTT方法是Tim Mosmann（1983）首创的一种测定细胞密度的比色法。该方法与同位素掺入法所得结果无显著差异6。MTT方法引用，使细胞生测反应终点的判断更加快速、简便、准确。适用于化学农药的毒力测定。国内在这方面的报道较少，国外也仅见一例用这种方法测定天然产物杀虫毒力的报道7。2分子及细胞组织水平的筛选模式：在分子及组织水平对杀虫剂的筛选主要是酶筛选法及以神经培养物作为材料的筛选。酶筛选法作为农药筛选方法之一，在国外大农药公司常被用于农药的高通量筛选，它除了具有高通量的优点，还具有快速、灵敏、简便和不受筛选试材生长状况影响等优点。其中研究最多的是乙酰胆碱酯酶。3.基因芯片：基因芯片技术是20世纪90年代后期诞生的，基因芯片的优势是能同时检测成千上万基因的表达，借助已解析的基因生物功能，可以评价和分析新受试动物的作用机理。毒力基因组学的优势使它在化学品的人类健康和环境生态风险评估中具有潜在的应用价值。4 展望农药的研究是涉及化学、生物学、生物化学、药理学、毒理学的一门综合学科，新农药的开发成功是各学科研究者共同努力的结果。而当今农药研究的特点，发现具有生物活性的物质或先导化合物越来越困难，开发成功率降低。在这种情况下要谋求农药研究向新领域发展，作为基础的是必须