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私立中原大學 醫 學 工 程 學 系 碩士學位論文 經濟型血糖感測器之製作及市售電極片 之評估 經濟型血糖感測器之製作及市售電極片 之評估 Making of An Economical Type Glucose Sensor and Assessment to Commercial Electrodes 指 導 教 授 廖 峻 德 博 士 研究生 林 志 達 中 華 民 國 九 十 一 年 七 月 摘 要 摘 要 本研究是利用酵素能夠識別特定分子的特性 並且催化這些分子進行氧化反 應 形成某特定物質之增減 當產生電化學反應可使該特定物質的變化轉換成電 訊號 再利用訊號的差異表現來表示酵素的消耗與特定分子定量間的關係 對於 進行可自然發生反應 需要提供一能量給反應物 經研究設定固定電壓為 0 6 伏 特以提供能量 此電壓提供系統在設計上包含了工作電極及參考電極 在工作電 極上的電位值由參考電極所控制 利用工作電極上的固定電位 量測因酵素電極 產生不同程度反應的電流量 藉由測定三種因素 工作電壓 酵素反應的酸鹼值 及血糖濃度的偵測範圍 則此反應所產生的電壓或電流量可量測出 並利用以上 結果對市售電極片做電壓產生特性及量測品質的評估 本研究在量測血糖濃度 時 設定濃度介於 100mg dl 與 290mg dl 之間 均可以 0 6 伏特作為最佳之工作 電壓 以此適當範圍對生理酸鹼值 6 6 至 7 6 之間實驗 測出酸鹼值對電壓對時 間變化並無明顯差異 同理 藉由上述條件以研究葡萄糖濃度影響因子 實驗結 果顯示 葡萄糖濃度對電壓產生的變化有顯著差異且具有高度重現性 因此可應 用到製作與設計血糖儀 在訊號讀取的設定上 由實驗得到測試時間在 35 秒至 70 秒間電壓對時間變化曲線呈線性 為避免放大器之截止時間相近 在快速檢 測的原則下選擇以 40 秒作測量時間 基於對上述因子的研究 針對市售商品 R 牌 B 牌及 A 牌做評估 在一定時間內的變化量中 以 R 牌的電壓對時間變化 最大 且在相關係數中 R 以 0 90 至 0 99 接近線性的程度最好 本研究因此提供 自製或篩選葡萄糖感測電極時的一種快速品質評估方法 關鍵詞 酵素 電極 電位 葡萄糖 Abstract This work is based upon the characteristic of an enzyme capable to recognize specific molecules to promote their oxidative reactions and to provoke quantitative changes of a particular reactant or product The extent of substance can be furthermore transformed into electrical signals when electrochemical reactions occur Variation of signals can be expressed as the relation between the consummation of enzyme and the quantity of the specific molecule For a spontaneous process a required energy is provided to the reactants the applied voltage for the energy is studied and fixed at 0 6V This voltage supply system includes a working electrode and a reference electrode The reference electrode controls the potential at the working electrode which records electrical currents from varied enzymatic reactions occurred at the electrode By evaluating three dependent parameters working voltage of enzyme electrode pH value of enzymatic reactions and detecting range of glucose concentration the voltage or current derivative from the reaction can be measured This study is also extended to commercially available electrodes and applied to assess their output voltage and quality of measurement The appropriate detecting range of glucose concentration is optimized in the range of 100 290mg dl The most sensible working voltage is fixed at 0 6V With these detecting levels the pH value in the range of 6 6 7 6 for enzymatic reactions does not significantly affect V t the change of measured voltage with respect to the measuring time Similarly we examine the influential factor of glucose concentration to V t a significant difference is obtained and the result is highly reproducible It is therefore applicable to design or to make glucose sensors The suitable measuring duration is set in the range of 35 70sec when V t is approximately linear To avoid electrical disturbance and to keep a quick response a measuring time of 40sec is optimized Based upon these factorial studies the commercially available electrodes R B 及 A are assessed Within the measuring time the V t for R is highest and its correlation coefficient is around 0 90 0 99 The result of this study is therefore valuable to provide a quick quality assessment for making as well as selecting glucose sensors Keywords Enzyme electrode potential glucose 誌謝 誌謝 本論文得以付梓首先要感謝指導教授廖峻德博士 於就學期間在學術研究之 精神與方法上給予學生的支持與指導 並在待人接物之哲學以及人生方向之思 維 提供學生無限的啟發 寶貴的意見及生活上的關心 並給予學生參與學術會 議討論研究的機會 使學生習得研究上所需的知識 同時也承蒙蔡正倫博士 王 士豪博士在口試時所提出的寶貴建議促使本論文更臻充實 完善 謹表達由衷的 謝意 在此特別感謝同步輻射中心王世杰學長提供學術上的指導及化學分析上的 協助 生物感測組研究室的伙伴 明誠及志強學長在實驗設計上的幫助及不厭其 煩的教導 與在生活上的關心 冠宏 登讚及奕德同學在平時的幫助及論文校稿 時提供的意見 啟元及俊傑學弟在硬體電路及電腦上的協助 以及育彰學長 淑 萍學妹及明哲及煌仁學弟的鼎力相助 還要感謝尚上公司同事林英毅先生的鼓勵 羅式公司吳建穎先生的支持 紫 藤廬國光姐 瑛琪和文玲的照顧 同學明慈和明綢在課業上的幫助及我最好的兄 弟志聖 榮俊及勝宗的關心 讓我的生活多采多姿 感謝我的父母及家人給我的支持與關懷 使我在求學的過程中沒有任何負 擔 能夠專心的研究完成學業 在此與你們一同分享這份喜悅與榮耀 夜幕已低垂了 好似此段歷程即將落幕 卻看見原本含苞著層層的考驗與艱 難的花朵 在困苦中含淚綻放出生命的芬芳 願這韾香之成果獻給最愛的家人 師長 好友及關心幫助我的朋友 告訴你們 我即將懷抱著成長的喜悅與無限的 感恩踏入另一個新的旅程 期待仍有你們一路相隨 目目 錄錄 中 文 摘 要 I 英 文 摘 要 I I 目錄 III 第一章 緒論 1 1 1 前言 1 1 2 文獻回顧 2 1 3 研究動機與目的 5 第二章 理論基礎 6 2 1 糖尿病生理背景 6 2 2 醣類的臨床檢驗 8 2 3 生物感測器 14 2 4 電化學分析 16 2 5 分析模式 26 第三章 材料與方法 27 3 1 實驗步驟 27 3 2 基礎實驗 28 3 3 經濟型血糖感測器之研製 29 3 4 相關係數與線性廻歸之分析步驟 32 第四章 結果與討論 33 4 1 不同工作電壓 不同酸鹼及不同濃度對 V t 差異之評估 33 4 1 1 不同工作電壓對 V t 差異之評估 33 4 1 2 不同酸鹼對 V t 之評估 38 4 1 3 不同濃度對 V t 差異之評估 41 4 2 R 牌 B 牌及 A 牌 V t 壓之各別分析 43 4 2 1 R 牌廻歸曲線分析 43 4 2 2 B 牌廻歸曲線分析 47 4 2 3 A 牌廻歸曲線分析 51 4 3 R 牌 B 牌及 A 牌 V t 之相互比較 55 4 3 1 V t 值之相互比較 55 4 3 2 相關係數值之相互比較 59 4 4 葡萄糖感測器之製作 63 第五章 結論 66 第六章 未來展望 67 參 考 文獻 圖索引圖索引 圖 2 1 信號頡取流程圖 圖 2 2 電解槽示意圖 圖 2 3 影響電極反應速率因素 圖 2 4 電解池中兩電極的極化曲線 圖 2 5 分解電壓的測定圖 圖 2 6 電壓 時間散佈圖 圖 2 7 相關係數及線性迴歸分析模式圖 圖 3 1 實驗步驟流程圖 圖 3 2 藥品的配製流程圖 圖 3 3 微生物感測器內部類比方塊圖 圖 3 4 安培計法感測器內部數位方塊 圖 3 5 程式流程方塊圖 圖 3 6 相關係數與線性迴歸之分析步驟流程圖 圖 4 1 在正常血糖濃度值 100mg dl 下不同電壓 0 2 0 4 0 6 0 7 及 0 8 10 至 60 秒之 V t 圖 4 2 在正常血糖濃度值 100mg dl 下不同電壓 0 2 0 4 0 6 0 7 及 0 8 60 至 500 秒之 V t 圖 4 3 在正常血糖濃度值 2900mg dl 下不同電壓 0 2 0 4 0 6 0 7 及 0 8 10 至 60 秒之 V t 圖 4 4 在正常血糖濃度值 2900mg dl 下不同電壓 0 2 0 4 0 6 0 7 及 0 8 60 至 500 秒之 V t 圖 4 5 在血糖濃度 100mg dl 下 10 50 秒間不同相關係數之 V t 圖 4 6 在葡萄糖濃度 290mg dl 下 10 50 秒間不同酸鹼值之 V t 圖 圖 4 7 在值 7 4 下 不同葡萄糖濃度之 V t 圖 圖 4 8 R 牌在不同電壓壓 不同濃度下之 V t 曲線圖 N 6 圖 4 9 R 牌在不同電壓壓 不同濃度下之相關係數 R 曲線圖 N 6 圖 4 10 B 牌在不同電壓壓 不同濃度下之 V t 曲線圖 N 6 圖 4 11 B 牌在不同電壓壓 不同濃度下之相關係數曲線圖 N 6 圖 4 12 A 牌在不同電壓壓 不同濃度下之 V t 曲線圖 N 6 圖 4 13 A 牌在不同電壓壓 不同濃度下之相關係數曲線圖 N 6 圖 4 14a 0 2 伏特電壓下 不同廠牌及不同濃度下之 V t 曲線圖 N 6 圖 4 14b 0 4 伏特電壓下 不同廠牌及不同濃度下之 V t 曲線圖 N 6 圖 4 14c 0 6 伏特電壓下 不同廠牌及不同濃度下之 V t 曲線圖 N 6 圖 4 14d 0 7 伏特電壓下 不同廠牌及不同濃度下之 V t 曲線圖 N 6 圖 4 14e 0 8 伏特電壓下 不同廠牌及不同濃度下之 V t 曲線圖 N 6 圖 4 15a 0 2 伏特電壓下 不同廠牌及不同濃度下之相關係數曲線圖 N 6 圖 4 15b 0 4 伏特電壓下 不同廠牌及不同濃度下之相關係數曲線圖 N 6 圖 4 15c 0 6 伏特電壓下 不同廠牌及不同濃度下之相關係數曲線圖 N 6 圖 4 15d 0 7 伏特電壓下 不同廠牌及不同濃度下之相關係數曲線圖 N 6 圖 4 15e 0 8 伏特電壓下 不同廠牌及不同濃度下之相關係數曲線圖 N 6 圖 4 16a 葡萄糖感測器之歡迎畫面 圖 4 16b 葡萄糖感測器之開始畫面 圖 4 16c 葡萄糖感測器之正在計數畫面 圖 4 16d 葡萄糖感測器之終了畫面 圖 4 17 不同濃度校正對應於 AD 值之關係圖 表索引表索引 表 4 1 血糖濃度與電壓反應 V t 最佳時間表 表 4 2 R 牌在不同電壓壓 不同濃度下之 V t 表 N 6 表 4 3 R 牌在不同電壓壓 不同濃度下之相關係數表 N 6 表 4 4 B 牌在不同電壓壓 不同濃度下之 V t 表 N 6 表 4 5 B 牌在不同電壓壓 不同濃度下之相關係數表 N 6 表 4 6 A 牌在不同電壓壓 不同濃度下之 V t 表 N 6 表 4 7 A 牌在不同電壓壓 不同濃度下之相關係數表 N 6 第一章 緒論 第一章 緒論 1 1 前言 前言 由於國人平均壽命不斷的延長 慢性病已取代了急性傳染病 成為國人最主 要的死因 慢性病若未能有效的控制病情 可能會引起諸多併發症 除了耗費更 多醫療資源外也將影響病人及其家屬之生活品質 鑑於此慢性病的照護已逐漸成 為衛生及保健重視的議題 慢性病中以糖尿病為國人高盛行率的疾病 45 歲以 上罹患糖尿病盛行率達 11 估計總人數超過 60 萬人 為國人十大死因的第五 位 且二十年間 因糖尿病死亡人數暴增五倍以上 因此造成相當的治療成本 1998 年因糖尿病患醫療費用佔總費用 11 5 其中有 60 8 用於門診 其餘則 支付住院費用 糖尿病照護成本為非糖尿病患之 4 3 倍 而糖尿病病患者若妥善 控制血糖 血壓 以及適當的追蹤管理 可顯著預防或延緩併發症的發生 照護 品質愈好 病人因糖尿病而手術 急診及住院之機率愈低 1 糖尿病的病因是由於自體免疫 Auto immune 或過濾性病毒之感染 導致 胰臟 細胞之破壞 以致於胰島素之分泌劇減而發病 另一方面亦可能是由於 肌肉或脂肪細胞對胰島素之阻抗力 Insulin resistance 增加 導致胰島素功能不 良 細胞之枯竭而致病 且可能由於體內他種荷爾蒙 具有抗拮胰島素 之 增加而導致血糖升高 糖尿病常帶來的各種併發症例如低血糖症 酮酸中毒 DKA 高血糖高滲透 壓非酮酸性昏迷 HHNK 及乳酸血症等 雖然糖尿病引起的併發症幾乎是無可避 免的 但卻是可以減少及延緩的 為了預防糖尿病急性症狀發生最有效的辦法就 是嚴格地控制血糖 以預防或延緩糖尿病的發生 自我監測血糖可以紀錄糖尿病患者的平日生活血糖值的變化 因而可控制飲 食 加以適當的活動和藥物的配合 紀錄之資料可提供醫療人員作為治療及藥物 調整的依據 以及減少併發症的發生 因此一個良好的掌上型簡易量測儀器必須 具備容易操作 需血量少 精確度高 體積小簡易的值顯示營幕及價格便宜等優 點 期以達便利使用之原則 1 1 2 文獻回顧文獻回顧 酵素電極發展至今已有數十年的歷史例如糖尿病 痛風 血脂症等病患的檢測 上 在於輔助檢驗醫療的用途上有相當重要的幫助 由於傳統的檢驗 須由專業 的檢驗人員操作大型的儀器且耗費時間才能達成檢驗的目的 因此開發掌上簡易 量測型的儀器 以提供慢性病患長期自我監控生理狀況的需求 進而達到居家護 理的目的 是可以節省醫療資源的浪費 以達到醫療資源的充分運用之目的 在食品工業上也可利用酵素感測器 量測對人體有害之過氧化氫 糖類 尿 酸 蛋白質及細菌等的濃度 或是作為食品腐敗的程度 量測之依據 自 1946 年 Folin 和 Malmors 提出利用葡萄糖在鹼性液中 轉變成烯二醇 enediol 構造 而將金屬離子或有機酸還原而測定葡萄糖的方法 葡萄糖加入 定量使用的被還原物有鐵鹽 銅鹽及鉍鹽等金屬離子 但血清中含有其它還原物 質 如尿酸 肌酸酐及維生素丙等也會參與反應 故對葡萄糖量測的專一性較差 因此測定值會比實際值高出 10mg dl 2 1974 年 R J L Bondar et al 使用還原鐵 鹽後以碘液滴定之方法 以氫氧化鋅製備血清去蛋白濾液 葡萄糖還原為鐵後 再以碘液滴定而來求出葡萄糖濃度 血清去蛋白濾液將銅還原成亞銅 CuO 後 再與砷鉬酸 arsenomlybdate 形成藍色之鉬酸藍 molybdenum blue 在 500 520 下比色 此法係利用氫氧化鋅 somogyi 去蛋白 除去血清之其它還原物 3 1984 年 H Allen 和 O Hill 用 Ferrocene 當電子傳遞子 在石墨電極上 酸鹼 值 7 溶液中以 160mV 測葡萄糖氧化的訊息 其線性範圍達 30mM 對 8mM 葡 萄糖反應時間約 60 至 90 秒 操作 50 小時後訊號達穩定 4 1990 年 A Heller 利用 redox gels poly 和 Cl 以交聯的方式將葡萄糖氧化酶固定在金旋轉電極上 以 Os complex 作為電子傳遞子偵測葡萄糖 其反應時間低於 10 秒 線性範圍約 10mM 此電極之穩定度可達三星期 5 1991 年 P D Hale et al 將葡萄糖氧化酶混合在碳糊電極中 使用不同比例之 ferrocene與siloxane共聚合物作為電子傳遞子 對葡萄糖作偵測 在電位 300mV 下對葡萄糖作測量 實驗發現混合比例對葡萄糖有很大的影響 此修飾電極之生 命期可達 7 個月 但操作電位太高 6 1992 年 G Arai 使用 mercapthydroquinone 為電子傳遞子 以電聚合的方式 在 0 5 伏特時將葡萄糖氧化酶和 mercapthydroquinone 在電極上聚合 形成含葡萄糖氧化酶的 poly 薄膜 於 0 3 2 伏特 20 除氧下偵測葡萄糖的氧化電流 其電流密度約 4 2 A cm2 線性可 達 20mM 反應時間小於 10 秒 7 1993 年 A Heller 用 Os bpy 2Cl2 當電子傳遞子 並以 Poly 1 vinylimidazole 和 Os bpy 2Cl2 形成鍵結 再利用 Poly ethyleneglycol diglycidyl ether 以交聯的方 式將葡萄糖氧化酶固定在電極表面 電極的特性受到葡萄糖氧化酶濃度 高分子 厚度 O2濃度 酸鹼值及 NaCl 濃度影響 含 39 葡萄糖氧化酶的電極 在 150Mv 下偵測葡萄糖可得到電流密度 400 A cm2 在此條件下仍有 ascorbic acid 及 acetaminophen 干擾 8 1993 年 G J Patriarche 使用 dual mediator 的方式來偵 測葡萄糖 以 glutaraldehyde 將葡萄糖氧化酶交聯在 Pall Imnunodyne 膜上 再固 定於玻璃碳電極上 然後在分析溶液中加入酵素傳遞子如 phenazine methosulfate 或 dichlorophenolindophenol 並加入 hexacyanoferrate 當作電化學反應傳遞子 由於 phenazine methosulfate 對葡萄糖氧化酶是有效的電子傳遞子 但它的還原態 在 O2存在下是不穩定的 故加入 hexacyanoferrate 來做為電子的傳遞 便可在 0 36 伏特下偵測到葡萄糖氧化的訊號 其線性範圍達 1 5mM 但偵測電位仍太 高 9 1994 年 W Joseph 和 K Jnozas 使用 Meldola Blue 7 dimethyl amino 2 benzophenoxaziniumsalt 當電子傳遞子 並將它與葡萄糖氧化酶一起混入碳糊製 成電極 在 50mV 的操作電位下偵測葡萄糖 其線性範圍達 25mM 在此電位下 對 5 10M 的 ascorbic acid 或 uric acid 有 4 7 的干擾發生 穩定的訊號可達 3 個 月以上 其電極表面可使用刀片切除而得到新的表面 其它 phenoxagine 預期有 相同的電子傳遞作用 10 1994 年 Y Okamoto 使用 poly ether amine quinone 當電子傳遞子 將它與石墨粉和葡萄糖氧化酶混合 在 45 至 50 下加熱 24 小 時 使葡萄糖氧化酶被固定在交聯的網狀高分子中 在此操作中不會因自由的擴 散而自電極表面流失 測量葡萄糖時操作電位在 0 4 伏特 Ag AgCl 其電流密度 為 6 7 A cm2 mM 此電極在大氣乾燥保存下穩定性超過 2 星期 但操作電位太 高 11 1995 年 J Wang 使用碳糊電極 以亞甲藍 methylene green MG 當電子傳遞 子 電極中含 5 GOX和 0 5 MG 在 68mV 酸鹼值等於 8 5 條件下偵測葡萄 糖 靈敏度為 18 1 A cm2 mM 對小於 20mM 的葡萄糖 反應時間約 30 秒 於 4 7 mM 葡萄糖時 乙醇及 paracetano 並不會對系統造成干擾 但對於 40m 的 3 ascrbic acid 有 2 4 的干擾 此電極訊號的大小視葡萄糖氧化酶和 MG 含量的多 寡而定 MG 含 4 時有最大的訊號 存於 4 下兩個月後仍保持 90 的訊號 12 1999年M Santucci et al在薄膜電極上利用斜率的方式來評估電壓 濃度特性 的 H2O2 實驗中發現在酸鹼值 7 4 緩衝溶液磷酸鹽 0 1M 下電壓 濃度特性的 H2O2線性範圍中 0 005 至 1mM 有薄膜電極對於 H2O2反應 會產生出增強許多 的還原電流 由此可知斜率對電壓 濃度特性的 H2O2具有相當靈敏度且快速的評 估能力 13 2000 年 J M Zen et al 在網版印刷銅電極上利用流動注入系統來偵 測 H2O2 直接在網版印刷電極上電鍍一層銅金屬 利用銅電極與 H2O2的濃度 實驗中發現銅網版印刷電極對於 H2O2反應 會產生出增強許多的還原電流 此 還原電流由印刷電極上的銅被氧化成具有催化性的氧化銅 在負電位能中很快地 被還原回來 而產生巨大之還原電流 由此可知它對 H2O2具有相當靈敏度且快 速的催化能力 14 2000 年 C Chiyui et al 利用 D glucose 的特異性很高 存在於血中的其他糖 類幾乎不會產生干擾的特性來量測葡萄糖 葡萄糖在水溶液中有 36 呈 型 64 呈 型 並以直鏈醛型保持平衡 故在反應中添加變旋酶 mutarotase 以 加速將 型轉變成 型 利用 4 aminoantipyrine 4 AAP 及 phenol 作為 H2O2 之氧接物以 BOD 方式測量葡萄糖氧化酶的反應 H2O2的產量與葡萄糖濃度成 比 因此 H2O2可用電化學測之 在鉑陽極 H2O2被氧化 其產物經由銀陰極還 原為水 15 綜合以上所提出利用電化學對於葡萄糖加以定性或定量分析的文獻資料結 果 發現葡萄糖測定大多以電子的傳遞 線性範圍及斜率來評估電壓 濃度特性 的 H2O2 先前葡萄糖的評估大都使用斜率的線性範圍 現在本研究使用線性廻 歸的斜率並且再加上相關係數來評估葡萄糖是比較簡便有效的方法 4 1 3 研究動機與目的 研究動機與目的 臨床檢驗分析是醫療保健中最基礎的一環 舉凡疾病診斷 預防 治療 癒 後追蹤及健康檢查等等 均需仰賴臨床檢驗分析之結果做為醫療專業人員判斷之 依據 傳統之臨床驗分析是將由病患取得之檢體 以生化反應等方法做病變之鑑 定 而往往須等一天至數天才能取得檢驗報告 因此若能發展一高靈敏度和正確 的感測器為感測器性能重要決定的因素 一個良好的掌上型簡易量測儀器必須具備容易操作 需血量少 精確度高 體積小簡易的顯示 判讀容易及價格便宜等優點 以使使用的病患能達到自我檢 測的效果 而自我監測血糖儀除可紀錄糖尿病患者的平日生活血糖值的變化 以 並暸解控制飲食 而活動和藥物的配合是否恰當 可由數據的提供讓醫療人員作 為治療及藥物調整的依據 減少併發症的產生 因此一個良好的掌上型簡易量測 儀器必須具備精確度高 但市售電極品質的優缺點並沒有一定有效的方法評估 本研究應用葡萄糖氧化酶與待測葡萄糖分子的酵素能夠識別特定分子的特 性 而定量偵測此酵素氧化反應 將有濃度變化的待測物質測得 並轉化電流或 電壓訊號 此訊號可做為酵素氧化反應與目標分子的關係再經由訊號放大與截取 得到實驗之結果 利用基礎實驗的工作電壓 血糖濃度及酸鹼值凡影響的結果可 歸納出設計安培計法的最佳化參數 利用這些參數實際設計一部血糖儀 其中包 含電路的設計 電路板的製作 元件的組裝 軟體的設計及電路的測試等 利用 簡易的放大器及類比 數位轉換及 8 位元單晶片 single chip 8 bit 而製作完成一 台可以控制工作電壓及補償電壓的血糖儀 由於各電極工作電壓及補償電壓不 同 並使用線性廻歸的方法在實驗中提供一個可靠評估電極的方法 而達到便穩 定 準確之原則 以期對未來血糖儀製作之改善 5 第二章 理論基礎 第二章 理論基礎 2 1 糖尿病生理背景糖尿病生理背景 糖尿病是因為人體內之胰臟所分泌之胰島素不足 絕對或相對 或作用不 良而使得糖份無法被人體所利用 轉化成熱能 以至於血糖升高所形成之一種新 陳代謝的疾病 而血糖超過 180mg dl 時 糖分便會經由尿中排泄出來因而被稱 為糖尿病 糖尿病的原因是多元性的 起因可由於是自體免疫或過濾性病毒之感染 導致胰臟 細胞之破壞 以致於胰島素之分泌劇減而發病 亦可由於肌肉或脂 肪細胞對胰島素之阻抗力增加 導致胰島素功能不良 細胞之枯竭而致病 或 由於體內他種荷爾蒙 具有抗拮胰島素 之增加而致血糖升高 15 另外亦可 能由於胰臟之發炎壞死 外傷切除造成沒有胰島素之分泌而致病 依據美國糖尿病學會 1997 年 6 月之建議糖尿病之分類 第一型糖尿病 過 去稱為胰島素依賴型 16 此一型糖尿病是由自體免疫所引起大部份病患會在 幼年或青少年時期發病 常伴有自家免疫之證據 病患容易發生酮體中毒 Ketoacidosis 的現象 需要注射胰島素及他命 第二型糖尿病 或稱為非胰 島素依賴型 病患常在 40 歲以後發病 多數有糖尿病家族史 常為肥胖病人 主要是細胞對胰島素產生抗拮所引起 胰臟為克服對胰島素之抗拮性 加倍分泌 胰島素 故初期常呈高胰島素血症 爾後 胰臟便衰竭而成分泌不足 此型糖尿 病患者較不易發生酮中毒 雖然糖尿病引起的併發症幾乎是無可避免的 但有效的控制血糖卻是可以 減少及延緩的併發症的發生 然而治療糖尿病 當然不光只是天天規則地服藥而 已 還必須定期地追蹤檢查 並且根據檢查結果去調整治療的處方 對於治療糖尿病 有兩個大型的研究經常被引用糖尿病控制與合併症試驗 DCCT 及英國前瞻性糖尿病研究 UKPDS 前者主要是研究第一型糖尿病 也就是過去所稱的胰島素依賴型糖尿病 後者則是針對第二型糖尿病或是稱為非 胰島素依賴型糖尿病所作的研究 這兩個研究中都證實了 嚴格地控制糖尿病 可以有效預防及減少微小血管的併發症 17 糖尿病所引起的急性併發症包括低血糖症 酮酸中毒 高血糖高滲透壓非 6 酮酸性昏迷及乳酸血症等 有關酮酸中毒或非酮酸性昏迷的症狀 糖尿病人若停 止口服降血糖藥或胰島素注射 血糖就迅速上升 病人會出現虛弱 飢餓 和頻 尿現象 嚴重者更會發生昏迷 有時身體因為不能利用葡萄糖 而改利用脂肪和 蛋白質當作能量來源 結果這些物質經代謝而產生酮體 因數量過多造成酮酸中 毒 病人會出現腹痛 噁心 嘔吐 呼吸急促及出現水果氣味 若不立即治療可 能導致昏迷及死亡 因此必須馬上送醫處理 葡萄糖為身體最主要的能量來源 當血糖降得太低 身體細胞即無法正常 工作此為低血糖併發症 當吃完東西後人體血糖升高 胰島素就會幫助葡萄糖進 入身體細胞 提供其運作能量 過剩的葡萄糖則被貯存於肝臟及肌肉中 成為肝 醣 當血糖降低時 細胞會分泌升糖素 刺激肝臟及肌肉釋出儲存的肝醣來 昇高血糖 這些過程都受到身體中胰島素 升糖素 腎上腺皮質酮 生長激素 及兒茶酚氨等賀爾蒙的嚴密控制 所以正常人的血糖非常穩定 大約在 60 115mg dl 之間 偶爾有些健康婦女甚至在 50mg dl 以下 並不會發生低血糖 症 當疑似這些症狀出現時應馬上測試血糖 進而進行治療 因為若不馬上醫 治 有可能進一步發生嚴重的低血糖而喪失治療的先機 因此 一個快速簡易 可居家使用的血糖量測儀便顯現其重要性 適當的血糖儀可做為一般人監測平時 建康狀態的指示 在高危險群及已患病者更是預防及治療成效的評估儀器 因此 必須發展簡便 準確的血糖評量儀器 2 2 醣類的臨床檢驗 醣類的臨床檢驗 醣類依據所含糖單位數目可分為三類單醣類 monosaccharides 寡醣類 oligosaccharides 及多醣類 polysaccharides 單醣類為簡單糖類 在合理 溫和的情形下不能被水解為更小的單元 適合此定義與實驗式的最簡單醣類為醛 糖類 甘糖醛 aldose glyceraldehyde 與它的異構物酮糖類 二羥丙酮 retose dihydroxy acetone 兩種糖皆含有三個碳原子為三碳糖 triose 此兩種糖類除 了可用含官能基 酫基與酮基 描述外 它們亦含有羥基 而甘油酫則有一個不 對稱碳原子 19 寡醣類為可以水解的單醣聚合體 具有二至六個簡單糖類分子 雙醣類 disaccharides 由兩個單醣單元組成 是自然界最為豐富的寡醣類 三醣類 7 trisaccharides 亦存於自然界 超過三個單醣單元的寡醣類經常可在醣蛋白 glycoproteins 的側鏈上被發現 多醣類為可聚合體 通常不溶於水 含有上千上百個單醣單元 在結構上為 直鏈的或具分枝性 聚合體如由一種簡單醣聚合而成 則稱為同多醣類 homopolysaccharide 如由兩種以上單醣聚合而成 則稱為異多醣類 heteropolysaccharide 一般多醣類是由單醣類如葡萄糖 glucose 木糖 xylose 及阿拉伯糖 arabinose 以糖甘鍵 glycosidic bond 聚合而成 1997 年 6 月美國糖尿病學會所建議之新的診斷標準如下 一 二次空腹 8 小時以上未進食 之血漿葡萄糖濃度 126mg dl 7 0mmol dl 二 隨機血漿葡 萄糖濃度 200mg dl 11 1mmol dl 並有多渴 多尿與其他緣故之體重減輕等 糖尿病症狀 三 口服耐糖試驗 OGTT 2 小時之血漿葡萄糖濃度 200mg dl 11 1mmol dl 使用 75mg 葡萄糖 四 空腹血糖濃度 Impaired fasting glucose IFG 過高空腹血漿 葡萄糖濃度 110mg dl 126mg dl 五 正常空 腹血糖 空腹血漿葡萄糖濃度 110mg dl 一般常見的檢驗法可分為還原法 Reducing method 縮合法 Condensation Method 酵素法 Enzymatic Methods 及葡萄糖去氫酶 Gluc DH 分敘如下 2 2 1 還原法 還原法 此法利用葡萄糖在鹼性液中 轉變成烯二醇 enediol 構造 而將金屬離子 或有機酸還原而測定之 葡萄糖家定量使用的被還原物有鐵鹽 銅鹽及鉍鹽等金 屬離子 有機酸方面有苦味酸 picric acid 3 6 dinitrophthalic acid 等 血清中 含有其它還原物質 如尿酸 肌酸酐 維生素丙及 glutathione 等也參與反應 故 專一性較差 因此測定值比實際值高出 10mg dl 以此法量測血糖者計有 1 Hagedron Jensen 氏法 為還原鐵鹽後以碘液滴定之方法 以氫氧化鋅製備血清去蛋白濾液 葡萄糖 還原鐵後 再以碘液滴定即而來求出葡萄糖濃度 其反應式如下 Glucose 2K3Fe CN 6 2KOH 2K4Fe CN 6 H2O gluconic acid 2 1 2K4Fe CN 6 3ZnSO4 K2Zn3 Fe CN 6 2 3K2SO4 2 2 2K4Fe CN 6 2KI 2K4Fe CN 6 I2 2 3 8 I2 2Na2S2O3 2NaI Na2S4O6 2 4 2 Somogyi Nelson 氏法 血清去蛋白濾液將銅還原成亞銅 CuO 後 再與砷鉬酸 arsenomlybdate 形成藍色之鉬酸藍 molybdenum blue 在 500 520 下比色 此法係利用氫氧化 鋅 somogyi 去蛋白 除去血清之其它還原物 故測定值較接近實際值 其反 應式如下 Glucose Cu OH 2 Cu2O 2 5 Cu2O arsenomolybdate molybdenum blue 2 6 3 Folin Malmor 氏法 葡萄糖將黃色之 K3Fe CN 6還原成無色之 K4 Fe CN 6 加三價鐵離子後形成 普魯士藍 prussian 以 515nm 比色 其反應式如下 Glucose K3Fe CN 6 K4 Fe CN 6 gluconic acid 2 7 K4 Fe CN 6 Fe3 purssian blue 2 8 2 2 2 縮合法 縮合法 醛糖或酮糖若與苯胺類 aromatic amines 如 O toluidine 在熱醋酸液中 會 形成縮合反應 產生顏色變化 H 100 Aldose o toluidine N aldosyl o toluidine H2O Schiff base 呈色物 2 9 此 類 苯 胺 物 有 鄰 甲 苯 胺 o toluidine 2 6 dimethylanaline 2 5 dimethylanaline p aminosalicylic acid p aminohippuric acid aminophenol aniline benzidine xylidine p bromoaniline 等 反應因糖類而異 其中以 o toluidine 優點較多 譬如特異性高 試藥易得 純度高 無致癌性 使用最廣 葡萄糖與 o toluidine 於 熱 冰 醋 酸 溶 液 中 縮 合 產 生 藍 綠 色 之 N 葡 萄 糖 醯 胺 9 N glucosylamine 630nm 比色 HCO C C C C CH2OH HO H H HOH H OH OH NH2 CH3 H 100OC CN C C OHH HO COH C H OHH CH2OH OH H CH3 H2O Glucose o ToluidneN Glucosylamine O toluidine 法為 1959 年 Hultman 首先介紹於葡萄糖之方法 此法後來經過很 多學者修改 包括添加 thiourea 為穩定劑 以硼酸 乳酸或檸檬酸為加速劑 以 cremophor EL 為混濁阻止劑 O toluidine 對六碳糖 五碳糖等醛糖均可反應 但 受黃疸及溶血標本之影響 此法較適用於手工操作法 2 2 3 酵素法 酵素法 酵素法主要分三種 葡萄糖氧化酶 glucose oxidase GOD 己糖激酶 hexokinase HK 及葡萄糖去氫酶 glucose dehydrogenase 等 1 葡萄糖氧化酶法 此法為 1928 年首度報告葡萄糖氧化酶催化作用 將葡萄糖氧化成葡萄糖醛酸 gluconic acid 及過氧化氫 20 其反應式如下 C C C OHH C HHO H CH CH2OH O HOH O2 H2O GOD FAD HOCH C C OH C H OH OH C H OH CH2OH H O H2O2 H D glucose Gluconic acid 此法對 D glucose 的特異性很高 存在於血中的其他糖類幾乎不會產生干 10 擾 葡萄糖在水溶液中有 36 呈 型 64 呈 型 並以直鏈醛型保持平衡 故在反應中添加變旋酶 mutarotase 以加速將 型轉變成 型 1948 年 Keilin 使用氣壓計 manometer 直接測定氧的消耗量 進而求出血 液葡萄糖濃度 近年來 測 H2O2反應生成物的方法已發展出下面數種 過氧化 氫法 GOD POD method 電極法 GOD POD electrode method 及觸酶法 GOD catalase method 茲分述如下 葡萄糖氧化酶 過氧化氫酶法 1956 年 Ketson 配合過氧化氫酶 peroxidase POD 使與氧接受色原物 chromogens o tolidine 非 O toluidine 進行呈色 反應的測定法 21 22 其反應式如下 GOD Glucose O2 2H2O gluconic acid 2H2O2 2 10 NH2 CH3CH3 NH2 H2O2 POD NH 33 NH CHCH H2O2 o Tolidine Oxidized 2 2 籃色 Teller 於同年 1956 使用 o dianisidine 為還原色素 產生紅色反應 後來 經許多學者修改提出 較重要者有 Saifer 1958 Kinsley 1960 Trinder 1968 及 Miskiewicz 1973 等 目前使用較廣者 為Trinder 1968 利用4 aminoantipyrine 4 AAP 及 phenol 作為 H2O2之氧接物 產生紅色的 quinoneimine 以 510nm 波長比色其反應式如下 POD 2 H2O2 4 AAP phenol quinoneimine 4 H2O4 2 11 葡萄糖氧化 電極法利用葡萄糖氧化酶的反應 產生 H2O2 H2O2的產量與葡 萄糖濃度成比 因此 H2O2可用電化學測之 在鉑陽極 H2O2被氧化 其產物經 由銀陰極還原為水 其反應式如下 11 GOD Glucose O2 2 H2O gluconic acid 2 H2O2 2 12 POD H2O2 2H O 2 2e 2 13 4H O 2 2H2O 4e 2 14 一般常用的抗凝劑 諸如氟化鈉 草酸鹽 肝素或不影響測定結果 故血清 或全血皆可檢查 葡萄糖氧化酶 觸酶法 Sunderman Sunderman 1961 利用 catalase 使過氧化 氫氧化甲醇成甲醛 formaldehyde 再利用 Hantzsch 反應與 chromotropic acid 或 acetylacetone 進行呈色反應測定 2 己糖激酶法 以己糖激酶催化己糖及 ATP 等基質 生成己糖 6 磷酸 hexose 6 phosphate 及 ADP 雖然此酵素對葡萄糖不具有特異性 但是由於更特異的酵素 G 6 PD formazan 等 茲分述如下 HK G 6 PD NADP UV 法 本法的專一性及精確度較佳 可作為標準的 參考法 此法為 Schmidt 1961 設計 包括兩組酵素及輔酶 進行下面三段反 應 23 step1 加磷酸作用 phosphorylation 由己糖激酶與 ATP 催化葡萄糖成為 glucose 6 phosphate G 6 P 此為不可 逆之反應 HK Mg2 Glucose ATP G 6 P ADP 2 15 Step2 脫氫作用 dehydrogenation G 6 PD 與 NADP 催化 G 6 P 成為 6 phosphoglucono 5 lactone 及 NADPH G 6 PD Mg2 G 6 PD NADP 6 phosphoglucono 5 lactone NADPH H 2 16 以波長 340nm 測吸光度增加量即得葡萄糖量 12 Step3 水解作用 hydrolysis 6 phos phoglucono 5 lactone 繼續水解成 6 phosphogluconate HK PK LDH NADH UV 法 為 Barthelmai 1962 所創 以 HK 作用 生成的 ADP 加上 phosphoenolpyruvic PEP 後 再與 pyruvate kinase PK LDH 及 NADH 作用 以 340nm 測 NADH 轉變成 NAD 之量 24 HK G 6 PD formazan 法為 Coburn Carroll 1973 設計的測定法 係以 HK 催化葡萄糖生成的 G 6 P 在 NADP 存在下 經 G 6 PD 作用產生 NADPH 後者再還原 nitro blue tetrazolium NBT 形成藍紫色的 formazan 以 490nm 比色 HK Mg2 glucose ATP G 6 P ADP 2 17 G 6 P NADP 6 phophogluconic NADPH H 2 18 NADPH H NBT NADP formazan 藍紫色 2 19 2 2 4 葡萄糖去氫酶葡萄糖去氫酶 葡萄糖去氫酶法與葡萄糖氧化酶法同樣地 祇對 D glucose 有特異性 須 在反應中加入變旋 mutarotase D glucose 與 NAD P 經 cose DH 作用生 成 NAD P H 後 以 340nm 測吸光度增加之量 其反應原理如下 Gluc DH glucose NAD P glucunolactone NAD P H H 2 20 13 2 3 生物感測器生物感測器 生物感測器用於定量定性之監測分析研究的發展在近十年來已經非常迅 速 其目的在使複雜的實驗室偵測方式簡化以達到實用 簡單 便宜及普遍之需 求 而生物感測器主要包括兩大部份 生物感測物質 Biospcific sensing element 和換能器 Transducer 生物感測物質