第二章核酸的化学.doc

第二章核酸的化学第一节核酸的概念和化学组成一、核酸的发现及研究进展1、最早1868年，瑞士科学家Miescher从绷带脓细胞中发现含磷2.5%的化合物，称为核素。2、1881年，Altmann从小牛胸腺、酵母中得到，它不含Pro，命名为核酸。3、1914年，把小牛胸腺中得到的核酸称胸腺核酸（动物核酸），把从酵母中分离得到的核酸称酵母核酸(植物核酸)。 又根据戊糖分为脱氧核糖核酸DNA和核糖核酸RNA4、1944年，Avery研究肺炎球菌转化实验，证明DNA是遗传物质的结论。最初是1928年，Gniffith以肺炎球菌作为转化的材料。肺炎球菌 光滑型（S型）：菌落光滑、有荚膜、有毒性。 粗糙型（R型）：菌落粗糙、无荚膜、无毒性。活体转化，四组实验： 活S型菌Ratdie 活R型菌Ratlive 加热杀死的S型菌Ratlive加热杀死的S型菌Ratdie活R型菌 说明R型菌可以转化为活S型菌，加热杀死的S型菌中有一种物质可使活R型菌转化为S型菌。1944年美国科学家Avery做了大量实验确定这种物质是DNA（转化因子）。5、1953年，沃森和克里克提出DNA的双螺旋模型结构，不但阐明了DNA结构，而且对DNA的复制、遗传物质的传递、都作了重要的说明。6、20世纪70年代，DNA重组技术应用基因工程诞生。7、20002002年人类基因组计划完成。二、核酸的概念和重要性核酸是由核苷酸组成的具有复杂三维结构的大分子物质，包括DNA和RNA。DNA主要分布在细胞核中；RNA分布在细胞质和细胞核中，主要有三种信使RNA（mRNA）、核蛋白体（rRNA）、转运（tRNA）。真核生物中还有HnRNA和SnRNA，HnRNA是mRNA的前体，SnRNA参与RNA的修饰加工等。DNA是遗传的物质基础。（一）核酸是遗传物质细胞核内DNA含量恒定，不受外界环境的影响。生物遗传特征的延续和生物进化都由基因所决定的。基因是具有遗传效应的DNA片段。（二）核酸参与蛋白质的生物合成mRNA是蛋白质合成材料，rRNA是核糖体的成分。三、核酸在医药上的应用1、RNA：来源与微生物发酵，动物内脏，可用于改善精神迟缓，记忆衰退，刺激造血，促进白细胞再生，治疗初级癌症。2、DNA：来源于微生物发酵，可用于改善疲劳，提高抗癌疗效。3、免疫核糖核酸（iRNA）：来源于免疫的动物内脏，用于肿瘤的免疫治疗。4、多聚核苷酸（polyC，polyI）：来源于微生物发酵和化学合成，作为干扰素的诱导剂。5、核苷-磷酸（IMP、CMP、UMP）：来源于微生物发酵。IMP：治疗肝炎、肾炎、白血球升高等症CMP；治疗肝炎、肾炎、白血球、血小板升高四、核酸的基本结构单位单核苷酸（一） 核苷酸的概念核酸水解生成核苷酸，核苷酸进一步水解生成核苷和磷酸，核苷再水解生成碱基和戊糖。核苷酸：由碱基、戊糖和磷酸组成和化合物，是核酸的基本结构单位。核酸分子中的碱基有两类：嘌呤碱和嘧啶碱，嘌呤碱主要有腺嘌呤A、鸟嘌呤G；嘧啶碱主要有胞嘧啶C、尿嘧啶U和胸腺嘧啶T，称为基本碱基。有些核酸分子中还有1-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤、N6-甲基腺嘌呤等，它们在核酸分子中并不多见，称为稀有碱基。核酸分子中的戊糖有两种：D-核糖、D-脱氧核糖，结构式如下：DNA和RNA分子的化学组成为 RNA DNA碱基 AGCU AGCT 戊糖 R dR磷酸 磷酸 磷酸（二）核苷酸的分子结构1、核苷 核苷：由碱基和戊糖缩合形成的化合物。 碱基与核糖缩合形成核糖核苷，碱基与脱氧核糖核苷缩合形成脱氧核糖核苷，如腺嘌呤与核糖缩合生成腺嘌呤核苷，简称腺苷，其它核苷可依此命名，它们的分子结构如下：（投影膜） 在核苷分子中，嘌呤碱基的N9与戊糖的C1连接，连接键为N-C键，一般称为N-糖苷键，并且戊糖环的C1-OH为构型，所以碱基与戊糖的连接为-糖苷键。为了与碱基相区别，将核苷分子中戊糖上原子的定位加“”表示。2、核苷酸核苷分子中戊糖环上的羟基磷酸酯化，形成核苷酸，也可称磷酸核苷。根据核苷酸分子中戊糖的不同，核苷酸可分为核糖核苷酸和脱氧核糖苷酸两类。核糖有3个游离羟基（2，3，5）因此可形成三种核苷酸；脱氧核糖只有两个游离羟基（3，5）。自然界中存在的游离核苷酸多为5-核苷酸（代号可略）。如5-腺嘌呤核苷酸，简称腺苷酸。，其它核苷酸的命名依次类推。（投影膜）五、核苷酸的衍生物（一） 多磷酸核苷酸凡含有一个磷酸基的核苷酸称为一磷酸核苷。其中5-一磷酸核苷的磷酸基可进一步磷酸化，生成5-二磷酸核苷和5-三磷酸核苷。以腺苷酸为例，结构式如下：（投影）常用的核苷酸及其简化符号见投影：常用的核苷酸及简化符号见表2-2一磷酸二磷酸三磷酸腺苷AMPADPATP鸟苷GMPGDPGTP胞苷CMPCDPCTP尿苷UMPUDPUTP脱氧胸苷dTMPdTDPdTTP生物体内多磷酸核苷具有重要的生物学作用。四种三磷酸核苷是合成RNA的重要原料，四种三磷酸脱氧核苷是合成DNA的重要原料。ATP在生物体内化学能的储存和利用中起重要的作用。（二） 环核苷酸5-核苷酸的磷酸基可与戊糖上的3-OH缩合形成3，5-环核苷酸。重要的环核苷酸有3，5-环腺苷酸（cAMP）和3，5-环鸟苷酸（cGMP），它们在组织细胞中起着传递信息的作用，称为“第二信使”。（三）辅酶类核苷酸一些辅酶属于核苷酸类衍生物。辅酶（NAD+）和辅酶（NADP+）都是腺嘌呤与尼克酰胺组成化合物，黄素单核苷酸（FMN）是异咯嗪、核醇和磷酸组成的化合物，黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）是由黄素单核苷酸与腺嘌呤核苷酸组成的化合物。辅酶A（CoA-SH）是由腺嘌呤、氨基乙硫醇和叶酸组成的化合物，它们在糖、脂肪和蛋白质代谢中起着重要的作用。第二节核酸的分子结构一、 DNA的分子结构(一)DNA的碱基组成 参与DNA组成主要四种碱基：A、C、G、T，还有少量稀有碱基。20世纪50年代应用纸层析及紫外分光光度计对各种生物DNA的碱基组成进行定量测定，发现如下规律：1、所有DNA中A和T的摩尔含量相等，即A=T，G和C的摩尔含量相等，即G=C，因此A+G=C+T。2、DNA的碱基组成具有种的特异性，即不同生物种的DNA具有独特的碱基组成，但无组织和器官的特异性，且生长发育阶段、营养状态、环境都不会影响DNA的碱基组成。（二）DNA的一级结构1977年，英国科学家Sanger首次测定噬菌体X174的DNA，它是单链，由5386个碱基组成。现已测定的最大噬菌体为-噬菌体。 DNA一级结构的定义：构成DNA的各个单核苷酸的数目和排列顺序。实验分子表明，核酸分子中相邻核苷酸之间通过3，5-磷酸二酯键连接。因为3，5-磷酸二酯键是在一个核苷酸的3-羟基与另一个核苷酸的5-磷酸之间形成的，所以由此连接的开链多核苷酸具有两端，戊糖3-羟基指向的一端称为3-末端，5-羟基指向的末端称为5-末端。DNA的一级结构即是DNA分子中核苷酸的排列。多核苷酸的分子结构书写格式可以写成线条式或文字缩写式如图:（投影膜） P和斜线代表3，5-磷酸二酯键,竖线表示核糖的碳链。（三）DNA的二级结构1953年，Waston and Crick提出DNA的双螺旋结构模型。（投影膜）1、DNA双螺旋模型提出的依据1）DNA碱基组成的分析：发现腺嘌呤和胸腺嘧啶含量相同（摩尔含量）A=T， C=G，说明可能A和T，G和C是配对的。2）碱基的理化数据分析：嘌呤碱大，嘧啶碱小，因此A-T，G-C配对是较合理的。3）DNA纤维X-光衍射结构分析：Franklin制得精致的DNA纤维X-光衍射图，表明DNA分子中3.4和34的周期性结构，说明DNA可能存在着双螺旋性。2、DNA双螺旋结构的特点1）DNA双螺旋分子由两条多核苷酸链组成，反向平行，即一条链走向35，另一条链为53，两条链均为右手螺旋，围绕同一中心轴形成右手螺旋。2）脱氧核苷酸和磷酸基形成的链为基本骨架，在螺旋外侧，碱基分布在螺旋内侧3）内侧互补的碱基通过氢键性形成，A-T之间形成三个氢键，G-C之间形成两个氢键。4）每个碱基对位于同一个平面内，碱基平面与中心轴垂直，相邻两个碱基距离为0.34nm，每螺旋一圈有10对碱基，相邻碱基平面距离为3.4 nm。5）双螺旋结构上有二条螺形凹槽，一条较深，一条较浅。较深的沟称大沟，较浅的沟称小沟。3、维持DNA结构稳定的作用力1）碱基平面之间堆积力是维持双螺旋结构的主要力量。2）碱基对之间的氢键。3）磷酸基团上的负电荷和介质中的阳离子形成的离子键。4、DNA双螺旋结构种类1）右手螺旋结构：由于DNA纤维的含水量不同，可分为三种：B-DNA、A-DNA、C-DNA。 B-DNA：Waston and Crick提出的DNA双螺旋结构为B-DNA，另外溶液和细胞中天然状态的DNA可能是B-DNA。 A-DNA：碱基与中心轴不相垂直，而呈20倾角。 C-DNA：可能存在于染色体与某些病毒的DNA中。三者区别见书本P91。2）左手螺旋DNA1979年，美国麻省理功学院Rich从d（GpCpGpCpGpCp）一段脱氧核苷酸链X衍射中发现，糖与磷酸的走向是曲折的，又把左手螺旋称为Z-DNA螺旋。Z-DNA和B-DNA的区别见P92。（五）DNA的三级结构定义：指DNA双螺旋链的扭曲或压缩。常见的形成超螺旋结构。1、DNA超螺旋结构形成原因由于某种原因使双螺旋多旋转或少旋转几圈，这样双螺旋内的原子偏离正常位点，产生额外压力，能量增大。如果双螺旋末端是开放的，这种张力可通过链的转动释放出来，DNA就恢复到原来正常状态。如果螺旋双端是闭和或固定（ 不能转动），那么这些张力就不能释放出来，只能在DNA分子内部，使原子位置重新排列，这样使得DNA发生扭曲，即超螺旋结构。2、生物体内的超螺旋结构在细菌、真核生物中的环状DNA，叶绿体DNA是超螺旋结构。生物的细核内DNA是线形双螺旋DNA，当两端固定时，可形成，例如：人的染色体DNA与组蛋白结合，成环状DNA，形成核小体，许多核小体串联在一起，再经过反复折叠缠绕、压缩形成超螺旋结构。二、RNA的种类和分子结构生物细胞内含有三种主要的RNA，即转运RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）信使RNA（mRNA）。（一） 转运RNA（tRNA）占全部RNA的15%，分子量较小，在2.5104左右，由7090个核苷酸组成。tRNA在蛋白质生物合成过程中具有转运氨基酸的作用。细胞内tRNA种类很多，每一种氨基酸都有相应的一种或几种tRNA。对tRNA的分子结构较为清楚，它的结构特点主要有：1、分子量25kd左右，由7090个核苷酸组成，沉降系数在4S左右；2、碱基组成中有较多的稀有碱基；3、3末端都为CpCpAOH，用来接受活化的氨基酸。称为接受末端4、5-末端大多为pG，也有pC的；5、tRNA的二级结构都呈三叶草（见投影膜）。双螺旋区成了叶柄，突出区好象三叶草的三片小叶。由于双螺旋所占的比例较高，tRNA的二级结构十分稳定。三叶草型结构由氨基酸臂、二氢尿嘧啶环、反密码环、额外环和TC环等五部分组成。1）氨基酸臂：由7对碱基组成，富含鸟嘌呤，末端为CCA，接受活化的氨基酸。2）二氢尿嘧啶环：由812个核苷酸组成，具有两个二氢尿嘧啶，通过3-4对碱基组成的双螺旋区与其余部分相连。3）额外环反密码环：由7个核苷酸组成。环中部为反密码子，由3个碱基组成，反密码环通过由5对碱基组成的双螺旋区与其余部分相连。4）额外环：由318个核苷酸组成。不同的tRNA具有不同大小的额外环，是tRNA分类的重要指标。5）假尿嘧啶-胸腺嘧啶核糖核苷环（TC），由7个核苷酸组成，5对碱基组成的双螺旋区与其余部分相连。6、tRNA的三级结构 酵母丙氨酸tRNA三级结构呈倒L型（见投影膜）（二） 信使RNA（mRNA）大多数真核生物细胞mRNA在3末端有一段约200个核苷酸的polyA（多聚腺嘌呤）。原核生物细胞mRNA一般无3polyA 。polyA 的功能主要是：与mRNA从细胞核到细胞质的转移有关；与mRNA的半衰期有关，新合成的mRNA，polyA链较长，而衰老的mRNA，polyA链较短。真核生物细胞5-末端还有一个特殊结构：即7-甲基鸟嘌呤核苷三磷酸，称为5-cap。目前认为5-cap可能于蛋白质合成的正确起始作用有关。（三） rRNA含量大，占细胞RNA总量的80%。是构成核糖体的骨架。动物细胞核糖体rRNA有四类：5 SRNA、5.8 SRNA、18 SRNA、28 SRN。rRNA的功能迄今仍不清楚。第三节 核酸的理化性质与常用的研究方法一、核酸的分子量大分子化合物，。DNA分子量特别巨大，一般在1061010 之间。不同生物、不同种类DNA分子量差异很大，如多瘤病毒DNA分子量为3106，而果蝇染色体DNA分子量为81010。DNA具有双螺旋结构，使分子具有一定的刚性，但DNA极为细长，又具有柔性。RNA分子量在数百至数千万之间。二、核酸的溶解性和粘度DNA和RNA属于极性化合物，微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。但其钠盐在水中的溶解度大，如RNA在水中的溶解度可达4%。DNA分子细长，分子长度有的达数厘米，如人的第十三对染色体DNA分子量为6.41010，伸展长度可达3.2厘米，而分子直径只有2nm，因此即使稀溶液也有很大的粘度。当DNA变性时，分子形状由双螺旋变为无规线团，空间伸展长度变短，使溶液粘度降低，因此可用粘度作为DNA变性的指标。三、核酸的的酸碱性质核酸分子中具有很多呈酸式解离的磷酸残基和呈碱式解离的氮原子，因此核酸是两性电解质，在水溶液中能发生两性电离，具有等电点。DNA双螺旋两条链间氢键的形成与其解离状态有关，在PH4.011.0范围内碱基最稳定。由于磷酸基的PK值较低，所以当溶液PH大于4.0时，核酸呈多介阴离子状态，易于碱性蛋白，如组氨酸结合。四、核酸的紫外吸收嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240290处有吸收峰，其中在处有最大的吸收值。对待测样品中是否纯品可用紫外吸收分光光度计读出260nm与 280nmOD的OD值，从OD260nm /OD280nm的比值中即可判断样品的纯度。纯的DNA的OD260nm /OD280nm应为1.8，纯的RNA应为2.0。样品中如含有杂杂蛋白及苯酚，OD260nm /OD280nm比值明显下降。不纯的样品不能用紫外吸收法定量测定。对于纯的样品只要读出260nm的OD值，即可知含量。通常以1OD值相当于50微克/毫升双螺旋DNA，或40微克/毫升单双螺旋DNA（或RNA，或20微克/毫升寡核苷酸计算。这个方法既快速又相当准确，而且不会浪费样品。五、核酸的沉降特性溶液中的核酸分子在引力场中可以沉降。不同构象的核酸，蛋白质及其它杂质，在超速离心机的强大离心场中，沉降的速率差异很大，所以可以用超速离心法纯化核酸或将不同构象的核酸进行分离，也可测定核酸的沉降系数与分子量。应用不同介质组成密度梯度进行超离心分离核酸，效果更好。RNA分离常用蔗糖梯度。分离DNA时用得最多的是氯化铯梯度。应用啡啶溴红-氯化铯梯度平衡超离心，很容易将不同构象的DNA，RNA及蛋白质分开。这个方法是目前实验中纯化质粒DNA最常用的方法。离心完毕后，离心管中各种成分的分布可以在紫外光照下显得一清二楚（如图），蛋白质漂浮在最上面，RNA沉淀在底部，超螺旋DNA沉降较快，开环及线形DNA沉降较慢。六、凝胶电泳（一）琼脂糖电泳以琼脂糖为支持物。电泳的迁移率决定于以下因素：1、核酸分子大小：迁移率与分子量对数成反比2、胶浓度：迁移率与胶浓度成反比。常用1%胶分离DNA3、DNA的构向：一般条件下超螺旋DNA的迁移率最快，线形DNA其次，开环形最慢。但在胶中假如啡啶溴红时，上述分布次序回发生改变4、电流：一般不大于5V/cm，在适当的电压下，迁移率与电流大小成正比5、碱基组成：有一定影响，但不大6、温度：430都可琼脂糖凝胶电泳常用于分析DNA。由于琼脂糖制品中往往带有核糖核酸酶杂质，所以用于分析RNA时，必须加入蛋白质变性剂，如甲醛。电泳完毕后，将胶在荧光染料啡啶溴红的水溶液中染色。DNA与啡啶溴红结合后，经紫外光照射，可发出红-橙色可见光。0.1g的DNA即可用此法检出，十分灵敏。（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳以聚丙烯酰胺作为支持物。由于这种凝胶的孔径比琼脂糖凝胶的要小，所以可用于分析分子量小于1000bp的DNA片段，聚丙烯酰胺凝胶中不含Rnase，所以常用于RNA的分析。聚丙烯酰胺凝胶的核酸样品，经啡啶溴红染色，在紫外光照下，发出的荧光很弱，所以浓度很低的核酸样品不能用此法检出。四、核酸的变性、复性及杂交（一）变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，并不涉及共价键的断裂。多核苷酸骨架上共价键（3，5-磷酸二酯键）的断裂称核酸的降解。降解引起核酸分子量的降低。引起核酸变性的因素主要有：温度引起的热变性；由酸碱度引起的酸碱变性；尿素是聚丙烯酰胺凝胶时测定DNA序列时常用的变性剂。当将DNA的稀盐溶液加热到80100时，双螺旋结构即发生解体，形成无规线团。其理化性质也随之发生改变：1、260nm区紫外吸收值升高，原因是碱基的暴露2、粘度降低，因为失去了双螺旋结构，把粘度的改变作为DNA变性的指标3、浮力密度升高4、生物活性丧失DNA的变性的特点是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。通常把DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称该DNA的熔点或熔解温度，用Tm表示。DNA的Tm值一般在7085之间。DNA的Tm大小与下列因素有关：1、DNA的均一性 均一性愈高的样品，熔解过程愈是发生在一个很小的温度范围之内。2、G-C含量 G-C含量越高高，Tm越高。这是因为G-C对比A-T对更稳定。所以测定Tm值即可推出G-C含量。其经验公式为：G-C%=（Tm69.3）2.443、介质的离子强度 一般说离子强度较低的介质中，DNA的熔解温度较低，熔解温度的范围也很窄。而在离子强度较高的介质中，情况相反。所以常在1mol/LnaCl中保存。（二）复性定义：变性DNA在适当条件下，分开的DNA单链重新缔和为双螺旋结构的现象。DNA复性的条件：1、有适当的阳离子浓度 如钠离子浓度0.01mol/L2、适当的PH值，常用PH6.83、适当的温度（60）4、适当的DNA浓度和恢复性质时间（一） 核酸的杂交将不同来源的DNA放在试管里，经热变性后，慢慢冷却，让其复性。若这些异源DNA之间在某些区域有相同的序列，则复性时，会形成杂交DNA分子。DNA与互补的RNA之间也可发生杂交。以Southern印迹法为例，介绍DNA-DNA的杂交：将DNA样品经限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离。将胶浸泡在碱（NaOH）中使DNA进行变性，然后将变性DNA转移到硝酸纤维素薄膜上（硝酸纤维素薄膜只吸附变性后的DNA），在80烤46小时，使DNA牢固地吸住在纤维素薄膜上。然后与放射性同位素标记的变性后的DNA探针进行杂交。杂交须在较高的盐浓度及适当的温度（一般68）下进行数小时或数十小时，然后通过洗涤除去未杂交的标记物。将纤维素薄膜进行放射自显影。除DNA外，RNA也可用探针进行杂交。第四节核酸的分离与含量测定一、核酸的提取、分离与纯化核酸的分离纯化是研究核酸的结构、功能，开展基因工程的基础对核酸的分离纯化有两个要求：1、尽可能保持核酸的完整性和天然结构2、避免直接的污染。原因：1、在细胞中核酸大多数以核蛋白形式存在，脱氧核糖核蛋白（DNP）与核糖核蛋白（RNP）往往是混杂在一起。2、细胞中，还有许多蛋白质、糖、脂类（除核酸外）与核酸混杂在一起。3、核酸是大分子物质，本身不稳定，容易受热，强酸、强碱、机械张力的影响，核酸变性降解。4、在细胞中，还有DNase和RNase ，分别使DNA、RNA降解（一）DNA的分离纯化1、材料选择和处理根据分离纯化目的要求，选择合适材料1）如制备DNA制剂，选含DNA丰富的动物组织2）从植物中分离纯化DNA，选小麦组织在黑夜中培养35天生成黄化苗，以黄化苗为材料，容易破碎，干扰小。3）从细胞核细胞器中提取DNA，先分离所需的细胞核、细胞器。2、细胞的破碎1）动物细胞或植物可采取研磨破碎法，研成匀浆（低温操作）2）细菌细胞肽聚糖不易破碎其破壁法有：（1）化学方法：去垢剂法：SDS（十二烷基硫酸钠） 酶解法：溶菌酶SDS作用：A：溶解膜蛋白及脂肪 B：溶解核蛋白上的蛋白使核蛋白体解聚（Pro与核酸分开）C：抑制DNA酶和RNA酶（2）物理方法：冰冻复融法： 渗透压碎裂法超声波震动法研磨法在破碎的细胞中要防止DNAse对DNA的降解，往往在提取过程中加入DNase的抑制剂。常用的抑制剂有：EDTA（乙二胺四乙酸钠）、柠檬酸钠（两者都+能螯二价Mg2，降低DNAse的活性），SDS。3、DNP的分离在细胞中，DNA与蛋白质形成核蛋白DNP，而DNP又和RNP混杂在一起，根据DNP与RNP在NaCL中的溶解度不同，可以把它们分离在低浓度（0.14M）NaCL中，RNP的溶解度大于DNP在高浓度（2M）NaCL中，RNP的溶解度小于DNP4、蛋白质的去除1）有机溶剂法：氯仿异戊醇法（24/1）、苯酚法、苯酚氯仿法（1/1）2）蛋白水解酶法：在链霉菌中分离出来的光谱蛋白酶需进口，可用胰蛋白酶代替。然后用有机溶剂将酶蛋白去掉5、RNA的去除1）RNase法，RNA的浓度为50100g/ml