微生物实验讲义.doc

微生物学实验讲义绪论 实验课的目的与要求1、普通微生物学实验的目的掌握微生物的基本操作技能，了解微生物学的基本知识；加深对课堂理论的理解。同时培养同学认真观察思索、分析解决问题的能力和严肃认真的科学态度。2、普通微生物学实验课的要求a、实验预习 了解实验的目的和原理，做到每一步实验都心中有数。b、实验观察和记录 微生物实验的连续性较强，实验中也较常出现突发情况，所以要求同学认真细致观察，如实记录。c、实验结果 要求同学实事求是地填写实验结果，交给老师评阅。d、爱护公共财物并维护公共秩序：公用的仪器药品用后放回原处。对精密仪器（显微镜、天平）细心维护，轻拿轻放。从冰箱或温箱取放物品时要随时关门。对消耗性的材料、用品、药品要厉行节约（擦镜纸、滤纸条等）。3、实验室规则微生物实验不同于动、植物实验，我们会经常接触到一些致病菌或条件致病菌，所以希望大家严格遵守无菌操作，为保证自身及他人的健康，以防污染或感染。a、实验室的整洁 非必需书、物品请勿带入实验室，不得在室内吸烟、进食，实验后收拾、擦净桌子。b、实验时的需小心 如遇到盛菌试管打破或皮肤破伤要及时处理。c、实验培养的材料 标明自己的组别、处理方式，放入教师指定地点培养。d、实验后的灭菌 所用物品可进行3%来苏水浸泡消毒或高压灭菌。e、实验前后 工作之前先洗手，工作后用肥皂洗手。f、离开实验室 一定关闭、水、电、门、窗。第一部分 微生物的染色与形态结构的观察基本原理：虽然可以用相差显微镜等直接观察微生物的形态特征，但其应用有局限性；用电子显微镜可以观察到微生物的各种形态结构，但因其价格昂贵、设备条件要求高、操作也较复杂，应用上也受一定限制。所以，一般实验室仍常用普通光学显微镜来进行微生物形态学特征的观察。然而，微生物（尤其是细菌）细胞小而透明，当把细菌悬浮于水滴内，用光学显微镜观察时，由于菌体和背景没有显著的明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以，用普通光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于颜色的反衬作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及其某些细胞结构。因此，为了研究微生物的形态特征和鉴别不同类群的微生物，微生物的染色及形态结构的观察是微生物学实验中十分重要的基本技术。用于微生物染色的染料，是一类苯环上带有发色基团和助色基因的有机化合物。发色基团赋予化合物的颜色特征，助色基团则赋予化合物能成盐的性质，仅含发色基团的苯化合物（称色原）即使带有颜色也不能作为染料，因为它不能电离，不能与酸或碱形成盐，对微生物（或其他材料）没有结合力，很容易被洗脱或机械方法除去。染料通常都是盐，分酸性染料与碱性燃料。在微生物染色中碱性染料较为常用，如美兰（亚甲兰）、结晶紫、碱性复红、番红（即沙黄）、孔雀绿等都属碱性染料。这部分实验着重于细菌的染色观察，同时也进行放线菌、酵母菌和丝状真菌的形态学观察。其目的是使同学在掌握细菌染色观察技术的基础上，了解其它微生物形态结构的观察方法；初步认识各类微生物的形态特征，巩固课堂知识，增强感性认识。实验一 细菌形态与运动性观察实验目的：1、掌握悬滴法、压片法观察细菌运动的技术2、学会显微镜下辨别细菌的运动性和非运动性3、通过压片染色，观察细菌的形状实验原理：1、悬滴法是普通光镜观察细菌运动的常用方法。过程大致如下：用接种环取适量污水滴在盖玻片上将盖玻片翻转置于凹玻片上封闭好后，减弱光圈，观察污水中细菌的形态及运动。压片法（即水浸片法）:取适当量的污水滴于载玻片上用干净盖片从一端轻轻放下，将水滴压开（注意防止气泡产生）置显微镜下观察。2、镜下观察时，活菌往往都在不断运动，但有些运动是细菌本身的运动而另一些是由于水分子运动而引起的布朗运动。如何区分呢？细菌的运动如鱼在水里游泳，各有一定前进方向，且可以改变运动方向；后者只是由于液体流动而引起的细菌在原来位置上稍有变化的摇摆颤动。3、细菌的个体微小常常为无色透明，往往需要给其染色、增加色差，以利于观察。另外不同细菌的菌体各部分对某些染料的着色性不一，因此染色还可以区分不同的菌种并识别菌体的各部分。染色时应注意：载片干净，无油腻（要求碱洗，酒精泡）涂拌的菌体切勿太多 加热固定或染色切忌过度或不足实验物品、器材（提示同学检查自己的实验用品）显微镜 擦镜纸 香柏油 凹玻片 盖玻片 载玻片 凡士林（或浆糊）滤纸条 玻璃蜡笔 接种环或接种针 污水 做好动球杆菌的成片 盛废物品的平皿实验过程1、悬滴法2、水浸片法（1、2参见实验指导）3、压片染色法：在前述水浸片法的基础上，观察到细菌的形态后，取下载片，用吸管滴一滴0.1%美兰于盖片边缘，对侧用滤纸条轻吸，染色观察。实验要求与结果1、观察各种类型菌的运动，注意区分真正运动和布朗氏运动。观察各种菌的形态特点，并绘出球菌、杆菌和螺旋菌的形态。实验小结：1、教师提前做好，课上演示2、结束之前，检查及摆放桌上的东西。3、显微镜的擦拭、维护。4、灯的使用及显微镜的各部分结构要讲解。实验二 细菌的简单染色法实验目的1、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法。2、初步认识细菌的形态特征。3、巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。实验原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带负电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。实验器材1、菌种 枯草芽孢杆菌12-18h营养琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物。2、染色剂 吕氏碱性美蓝液（或草酸铵结晶紫染液），齐氏石炭酸复红染液。3、仪器或其他用具 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等。实验步骤1、涂片 取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环挑取1-2环）生理盐水（或蒸馏水）于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液（或液体培养物）涂片，可用接种环挑取2-3环直接涂于载玻片上。*载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。2、干燥 室温自然干燥。3、固定 涂面朝上，快速通过火焰2-3次。*此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。热固定稳定不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。4、染色 将玻片上平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。吕氏碱性美蓝染色1-2min；石炭酸复红（或草酸铵结晶紫）染色约1min。5、水洗 倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。*水洗时，不要直接冲涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜急、过大，以免涂片薄膜脱落。6、干燥 自然干燥，或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。7、镜检 涂片干后镜检。*涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。实验报告1、根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。2、思考题你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？为什么要求完全干燥后才能用油镜观察？如果你的涂片未经热固定，将会出现问题？如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢？实验三 革兰氏染色法实验目的1、学习并初步掌握革兰氏染色法。2、了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。实验原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，而后一些学者在此基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如番红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，象简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结构的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的。本实验将介绍被普遍采用的Hucker氏改良的革兰氏染色法。实验器材1、菌种 大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物，蜡样芽孢杆菌（B. cereus）1220h营养琼脂斜面培养物。2、染色剂 革兰氏染色液。3、仪器或其他用具 同实验五。实验步骤1、制片 取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。*要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。2、初染 滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1-2min，水洗。3、媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。4、脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。*革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是格兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间一般约20-30s。5、复染 用番红染液复染约2min，水洗。6、镜检 干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色是革兰氏性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。7、混合涂片染色 按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌或大肠杆菌和金黄色葡萄菌作为混合涂片、染色、镜检进行比较。实验报告1、结果 列表简述3株细菌的染色观察结果（说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应）。2、思考题（1）你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？最关键的环节是什么？（2）现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行特制片染色，以证明你的染色结构正确性。（3）你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。（4）进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？（5）革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？（6）你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？实验四 细菌的芽孢染色法 一、目的要求1、学习并掌握芽孢染色法。2、初步了解芽孢杆菌的形态特征。二、基本原理芽孢又叫内生孢子，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。由于芽孢壁厚、透性低、不易着色，当用石炭酸复红、结晶紫等进行单染色时，菌体和芽孢囊着色，而芽孢囊的芽孢不朝色或仅限得很淡的颜色，游离的芽孢呈淡红或淡蓝紫色的圆或椭圆形的圈。为了使芽孢着色便于观察，可用芽孢染色法。芽孢染色法的基本原理是：用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使然料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。三、器材1、菌种 蜡样芽孢菌约2d营养琼脂斜面培养物，球形芽孢杆菌1-2d营养琼脂斜面培养物。2、染色剂 5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液。3、仪器或其他用具 小试管、滴管、烧杯，试管架，载玻片，木夹子，限微镜。四、操作步骤（一）改良的Schaeffer-Fulton氏染色法1、制备菌悬液加1-2滴水于小试管中，用接种挑取2-3环菌苔于试管中，搅拌均匀，制成浓的菌悬液。所用菌种应掌握菌龄，以大部分细菌已形成孢囊为宜；取菌不宜太少。2、染色 加孔雀绿2-3滴于小试管中，使其与菌液混合均匀，然后将试管置于沸水浴烧杯中，加热染色15-20分钟。3、涂片固定 用接种环挑取试管底部菌液数环于洁净载玻片上，涂成薄膜，然后将涂片通过火焰3次，温热固定。4、脱色 水洗，直至流出的水无绿色为止。5、复染 用番红染液染色2-3分钟，倾去染液并用滤纸吸干残液。6、镜检 干燥后，用油镜观察。 芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体呈红色。 第一部分总结单染色及运动学观察实验目的 1、掌握显微镜的结构、规范使用方法 机械装置、光学系统（调节方法） 使用方法：注意取、调、整理、收的系列规范操作。 2、观察三形 3、学习单染色法 革兰氏染色实验目的 1、学习并掌握油镜的使用方法原理：香柏油防止光折射，因为油镜凸度最大，焦距最短，但是需要光照最强，为了使通过的光线尽量少损失，要增加照明亮度。增加显微镜分辨率。LM能辨别两点之间最小距离的能力由/2NA决定，：光玻长 NA数值孔率=镜口角与香柏油（介质）折射率=nsin: 光线最大入线角的半数*油镜数值孔径最大，可分辨率要0.2um使用：*小心移动：镜头/载物台移动、香柏油、下旋细调螺旋擦拭：先用二甲苯擦香柏油（二甲苯易于使镜头污染、长菌、模糊）再干净镜头纸擦净二甲苯2、理解革兰氏染色的原理3、学会革兰氏染色的方法第二部分 微生物个体的测定实验五 微生物大小和数量的测定实验目的：1、学会测微尺的使用和计算方法 2、掌握细菌数量的测定方法实验内容：1、认识测微尺（目镜测微尺和镜台测微尺），并学习目镜测微尺的标定。目镜测微尺：圆形玻璃片 5mm等分50份（或等分100份） 每格所代表的长度随接目镜、接物镜的放大倍数而改变，因此使用前须用镜台测微尺标定。镜台测微尺：中央有精确等分线的载玻片，一般1mm分成100个小格，10m/小格，作用：标定目镜测微尺。目镜测微尺的标定：a、将镜台测微尺放载物台上（此时目镜测微尺已经安装于目镜筒中）b、 低倍镜找到镜台测微尺c、 转动目镜，使其测微尺上的刻度与镜台测微尺上，刻度平行。d、移动推进器使目镜测微尺的刻度线完全重合。e、 计算重合线之间各自的格数 以公式 目镜测微尺每小格长度（m）= 用相同方法校正物镜为40、100时，目镜测微尺的每小格所代表的长度。2、血球计板直接计数法（上课详讲）实验过程1、酵母菌菌体大小的测定取下镜台测微尺，放好事先做好的酵母菌涂片在低倍镜找到目的物用高倍镜或油镜测菌体大小（d）（目镜测微尺格数相应放大倍数下每格标定长度）测定1020株菌体，求出平均值，即为该种酵母菌的大小。2、酵母菌数量的测定稀释样品，（取少量酵母菌100ml水中）标准：每小格内约有5-10个菌体。检测血球计数板的清洁度（不洁净要重新清洗）。加样 把盖玻片放在计数室上，吸取少量稀释液于盖玻片边缘，使其自行渗入（多余菌液滤纸吸去）。计数 将血球计数板放在载物台上，低倍镜下找计数室，于高倍镜下找到清晰的计数室线条。按下述方法取值：25中方格：5个中方格中的菌体数16中方格：4个中方格中的菌体数注：方格边线上的只计算上方边线和右边线上的菌出芽生殖状态的菌，视芽体大小而定，当其体积达母细胞一半时，即视作两个菌体。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来取平均值计算公式菌细胞数/ml=每小格中菌数平均数400104稀释倍数清洗血球计数板 较大水流冲洗（均匀刷洗）自行晾干。实验作业1、菌体大小的测定2、酵母菌数量测定（表格参考实验指导）本次实验总结在讲解实验原理内容时，只讲目镜测微尺与镜台测微尺如何标定即可，至于原理可少讲。突出目镜测微尺不是直接测量细菌，而是观察显微镜放大之后的物体。重点提示镜台测尺只用来标定目镜测微尺，不可用做载玻片。有关计数镜下非染色的血球计数板计数计量总细胞数，计算镜下的亮点即可。计数时所加的菌液要适量不可太小，否则计数室难以充满。若过多，则用手按压盖玻片，吸水纸吸弃。计数时若粗略统计，可不论中方格还是小方格，25则取5个，6则取4个，计算起来方便得多。本次实验不足之处：实验前应重点讲解计数室的网格构造。大网格中只出现中方格划痕，而真正在计数室中才出现小方格，所以其上下左右方的格都是长方格。关于用光聚光镜要适当下调，使视野变暗第三部分 培养基制备及土壤微生物的分离实验六 培养基制备及灭菌一、目的要求：了解培养基的制备原理并掌握其制备过程学会高压蒸汽灭菌技术学习玻璃器皿灭菌前及准备工作并学会干燥箱的使用二、基本原理培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的营养基质，其中含有碳源、氮源、无机盐、生长因素及水分等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适酸碱度范围才能表现它们最大生命力，因此对不同种类的微生物应将培养基调节到一定的PH值范围，培养基的种类很多，不同的微生物所需要的培养基不同，就它们的物理性状来分，可分为液体的、固体的和半固体的三种。固体培养基是在液体培养基中加入1.52%的琼脂，半固体培养基是加入0.20.5的琼脂。三、器材药品：牛肉膏、蛋白质、NO、CL、马铃薯（或葡萄糖）、琼脂、10%HaOH、10%HCL。其他：试管、烧杯、PH试纸、沙布、棉花、天平、电炉等。四、操作步骤培养基制备1、称量：按照培养基配方，准确称取各成份放于烧杯中。2、熔化：向上述烧杯中加入所需水量，搅匀，然后加热使其熔解。如是配制固体培养基，在琼脂熔化的过程中，需不断搅拌并控制火力不要使培养基溢出或烧焦，待完全熔解后，补充所失水分。如果配方中含有淀粉，则需要将淀粉用少量冷水调成糊状并在火焰上加热搅拌后加足水份及其他药品，待完全熔解后，补充水份。3、调PH值：初制备好的培养基往往不能符合所要求的PH值，故需用PH试纸或酸度计校正，用1M HCL调PH至所需范围。4、过滤：用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求的情况下这一步可以省去。5、分装：根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上以免浸湿棉塞，引起污染。（1）液体：分装高度以试管高度的1/4左右为宜。（2）固体：分装试管，其装量为管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的容量以下不超过三角瓶容积的一半为宜。（3）半固体：分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂。6、灭菌：培养基分装好了以后，塞上棉塞，外面再包一层牛皮纸或双层报纸，便可进行灭菌。培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果及不损坏培养基的必要成份，培养基经灭菌后，必须放37温室中培养24小时，无菌生长者方可使用。 根据配制培养基的一般步骤，按下列配方配制培养及： 1、肉汤蛋白胨培养基 牛肉膏 3克 蛋白胨 10克 NaCI 5克 琼脂 1520克 水 1000毫升 PH 7.07.215磅/英寸2，灭菌20分钟。 2、马铃薯培养基： 马铃薯 200克 糖（葡萄糖） 20克 琼脂 1520克 水 1000毫升 PH 自然 15磅/英寸2，灭菌20分钟。 制作：马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后纱布过滤，再加糖及琼脂，熔化后补充水至1000ml。附 无菌水及生理盐水：将一般的水装入试管或三角平中进行灭菌即为无菌水，配制成0.85%的HaCI溶液，待盐溶解后装入试管或三角瓶，塞好棉塞进行灭菌，即为无菌生理盐水。棉塞的制作：一般应用微生物多是好氧微生物，所以在培养时要供给氧，棉塞可以过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发，故在微生物研究中一直普遍使用着。正确的棉塞是形状、大小、松紧与试管口（或三角瓶）完全适合，过紧时妨碍空气的流通，操作不便；过松时，空气中的微生物就可以侵入，达不到滤菌的目的，棉塞过小又往往容易掉进试管或三角瓶中。松紧以手提棉塞，瓶管不下落为准，正确的棉塞头较大，约1/3在外，2/3在试管中。 （二）玻璃器皿的洗刷和包扎： 1、洗刷：在使用前用洗液或去污粉洗刷或用水冲净。 2、玻璃器皿灭菌前的准备。(1) 几套培养皿一起用纸包装。(2) 吸管应在距离口约12毫米处用铁丝塞入棉花少许（约11.5厘米长）以防细菌吸如口中，并避免将口中细菌吹入吸管中。棉花要塞得松紧适宜，吹气以能通气但不使棉花滑下为准。将塞好的棉花吸管尖端，放在45厘米宽的长纸条的一端，约成45角，折叠报纸包住尖端，用左手捏住吸管身，右手将吸管压紧，搓动，每支吸管分别以螺旋式包扎起来，上端剩余报纸，折叠打结，准备灭菌。试管和三角瓶口，也需用棉花堵塞，上盖报纸，用绳捆扎，准备灭菌。附1、高压蒸汽灭菌锅的使用及注意事项：一般的培养基（包括固体、液体）、无菌水、工作服、玻璃仪器等适用于高压蒸汽灭菌。高压蒸汽灭菌是用耐高压密封的蒸汽锅，在密封的情况下加大压力，而使蒸汽的温度升高。其温度在100以上，利用高压蒸汽来达到灭菌的目的，有强大的杀菌力。一般培养基灭菌的蒸汽温度是121（蒸汽压力1.1公斤/cm2或15磅/英寸2）半小时可达到完全灭菌的目的。（1）高压蒸汽灭菌锅的构造，有各种形式及规格，基本构造大致如下：（图略）外锅：供装水产生蒸汽之用内锅：放置灭菌物的空间压力表：以表示锅内压力及温度（公制压力单位（公斤/cm2）、英制压力单位（磅/英寸2、温度单位（） ）。排气阀：用于排出空气。安全阀：又称保险阀。利用可调弹簧控制活塞，超过定额压力即自行放汽减压，以保证在灭菌工作中的安全。（2）使用方法及注意事项使用前的准备：锅内清洗干净，检查进气阀及排气阀是否灵活有效，并加入适量水。装放灭菌物：将待灭菌的物品放入锅内，注意不要放得太挤，以免影响蒸汽的流通和灭菌效果。然后加盖旋紧螺旋，使蒸汽锅密封。预热及排气：加热升温使水沸腾，并由小至大打开蒸汽阀，排除冷空气，继续加热升温。升压保温：让温度随蒸汽压力增高而上升待压力逐渐上升至所需压力时，控制热源，维持所需时间。降压出锅：保压到规定时间之后，就停止加热，降压到“0”时才能出锅。降压一般通过自行冷却。如果时间来不及，可以稍开排气阀降压，但排气阀不能开得太大，排气不能过急，否则锅内骤然降压，灭菌物内的液体就会突然沸腾，将棉塞冲湿，甚至外流。注意事项：此法灭菌是否彻底的一个重要关键是压力上升之前，必须先把蒸汽锅内的冷空气完全驱尽，否则，即使压力表已指到15磅/英寸2，而锅内温度则只有100，这样芽孢则不能被杀死，造成灭菌不彻底，所以必须进行排气。打开排气阀时不要太大。降压出锅不能太急，因而压力表上读数降至“0”时，灭菌物内温度有时还在100以上，如果开锅太快还有沸腾的可能，所以最好在降压后再稍停一会，使灭菌物温度下降后再出锅较妥当。灭菌物灭菌后仍在高温时，容器内是真空状，降温过程中外部空气要重新进入容器。一般叫“回气”，降温过快，回气就急，如棉塞不严密，空气中杂菌就会重新进入灭菌物使其污染，这往往造成高压蒸汽灭菌的失败。2、恒稳干燥箱的使用及注意事项：此法只适宜玻璃器皿，金属用具等的灭菌，含有水份的物质，不能用这种方法。把待灭菌的物件均匀地放入恒温干燥箱，加热至160170维持2小时即可达目的。（1）将包扎好的待灭物品（培养皿、吸管器等）放于箱内，注意不要摆得太挤，以免妨碍气流流通。（2）关门，插上电源插头（常为220伏），拨动开关，旋动恒温调节器，至红灯亮。（3）待温度上升160170时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2小时。（4）两小时后中断电源，待温度降至70以下之后，方可开箱取物，在这之前切勿自行打开箱门。五、为下一次实验准备培养基及器皿：（2人一组）1、培养基：牛肉膏蛋白胨制固体、液体、半固体、培养基装管（或装瓶）灭菌。液体：分装4支试管，每管4.5ml，一个50ml三角瓶内装25ml。固体：分装2管，灭菌后制成斜面，其余装500ml三角瓶中。半固体：分装6支试管，每管4ml。土豆糖培养基：配250ml，装三角瓶灭菌。2、包扎7支ml移液管及三套培养皿，两支空试管、两支离心管（均塞棉塞）。3、准备生理盐水2管（每管装5ml）。4、准备完毕后，玻璃器皿恒温干燥箱灭菌，其他置于高压蒸汽灭菌器中，15英磅/英寸2或1公斤/cm2灭菌30分钟。试验七 土壤微生物的分离与纯化一、培养基的配制实验目的学习牛肉膏蛋白胨、高氏一号、土豆糖（实验六）培养基的制备原理及其制备过程巩固高压蒸汽灭菌技术复习玻璃器皿灭菌前及准备工作实验内容（参照上一试验）实验材料和用具（参照上一试验，依实验内容多少而定）知识简介培养基：是指具有一定比例营养成份，一定PH值的，用来培养细菌，放线菌或真菌的混合养料。确切地说培养基是一种人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料。按其成分、物理状态等分类标准，培养基有不同的分类：按组分的不同有天然培养基，合成培养基和半合成培养基之分，今天我们接触到的牛肉膏蛋白胨培养基和高氏1号培养基分别属于前边两种，而与丁氏培养基则属第三种。前者是最广泛、最普通应用的细菌基础培养基，后者用来分离和培养放线菌，马丁氏培养基是专门用来培养真菌的。就它们的物理性状来分，可分为液体的、固体的和半固体的三种。固体培养基是在液体培养基中加入1.52%的琼脂，半固体培养基是加入0.20.5的琼脂。实验简介：无论天然还是组合（半）组合培养基，其制作过程大致都要称量溶解定容（调PH后定容）分装包扎灭菌摆斜面几个步骤。以下牛肉膏蛋白胨、高氏1号的配制即按上述步骤进行（以1000ml培养基为例）。程量药品配方牛肉膏3g 蛋白胨10gNacl 5g 琼脂 15gH2O 1000ml PH7.4-7.6可溶性淀粉20g KNO3 1gNacl 0.5g K2HPO43H2O 0.5gMgSO47H2O 0.5g FeSO47H2O 0.01g琼脂15g 水1000ml7.4-7.6仪器：大烧杯*牛肉膏称量可在称量纸上，放入热水中后、纸与牛肉膏分离、取出称量纸溶解并调PH要领：称好药品小火加热，不停搅拌，完全溶解后确定，补足水分定容。国产药品可能会产生沉淀，若要求较高可用滤纸纱布过滤，取滤过液调PH仪器：石棉网、玻璃棒、滤纸（纱布）1M NaOH 1M Hcl可容性淀粉可单独溶解之后加入其他成分，完全溶解后，确定补足水分。分装按实验要求进行同前仪器：试管、三角瓶、三角漏斗*分装量控制（固体培养基）试管高度的1/5三角瓶容积的1/2物品：棉花 牛皮纸（报纸）包扎*棉塞制作*包扎后标明日期成分同前灭菌121 湿热灭菌20 （压力1kg/cm2 or 15P/inch2 ）设备：高压取菌锅同前摆放制斜面斜面长度不超过试管长度的1/2同前无菌检查37温箱中24-48小时检查有无菌落长出同前高压蒸气灭菌方法（简要介绍、参见实验六）加水 水面与三角架相平装料 注意放气装配加盖 排汽管，相对拧紧螺栓排气 煮沸后，排冷空气5、打开排气阀升压并保压 关闭排汽阀，压力表指到1kg/cm2时计时，维持压力平稳到所需时间（121 20）降压 自然降低压力后排净余气无菌检查 37 24小时二、接种与菌落观察（一）平板划线法1、倒平板 融化固体培养基，冷却到50左右， 倾倒适量(20-25ml)平放待凝2、划线接种 目的获得单个菌落，使用接种环操作3、培养： 倒置，平放于37温箱中 细 菌: 1-2d， 放线菌：5-7d， 霉 菌：3-5d（二）斜面接种法1、做斜面（详见上述）2、无菌接种 接种环，由下往上之字划线 *动作要轻、勿破表面3、培养 30或37，细菌大约2d，放线菌、霉菌至孢子成熟（三）微生物菌落观察1、肉眼观察 小 扁平或隆起 细 菌 湿润，正反面颜色一致 大 扁平或隆起 酵母菌菌落 小 而致密 放线菌 干燥，正反、中央与边 大 疏松缘颜色不一致 致密 霉 菌 细致区分还要用显微镜，观察细菌形态。第四部分微生物的生理生化反应实验八 细菌鉴定中常用的生化反应试验实验目的 1、了解细菌鉴定中常用的生化反应及其原理 2、学习微生物的接种技术； 3、通过了解不同种类细胞段含碳化和物及含氮化合物的分解利用情况，以认识细菌代谢类型的多样性。基本原理由于各种微生物的新陈代谢类型不同，因此对个这种物质利用后所产生的代谢产物也不同。我们可以用化学反应来测定微生物的代谢产物，这种反应称为生化反应。生化反应常用来鉴别在形态或其他方法不易区别的微生物，例如肠道细菌中，大肠杆菌和伤寒杆菌。二者在形态上不易区分，但前者能发酵乳糖，后者不能。因此可以从它们能否发酵乳糖来区别它们，所以微生物的生化反应是微生物的分类鉴定的重要依据之一,本实验包括若干小小项经典的生化实验,如淀粉水解实验.糖类发酵实验、乙酰甲基醇试验（V-P试验），吲哚试验硝酸盐还原试验，明度液化实验。实验器材菌种：大肠杆菌，枯草杆菌；变形杆菌 ，产气杆菌。培养基：糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖），葡萄糖蛋白胨水，淀粉培养基；蛋白胨水，明胶培养基；硝酸盐培养基。试验：吲哚试剂、格里斯氏（Grless）试剂A、B、C二苯胺试剂，VP试剂。操作步骤：（一）糖类发酵试验：糖发酵实验是最常用的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌能利用糖类作为能源及碳源，但是细菌在分解糖类的能力上有相当大的差异，某些菌能 使某些单糖或双糖分解，并产酸（乳酸、蜡酸、丙酸）和气体（甲烷、氢、二氧化等）。或者只产酸而不产生气体、酸和气体的产生与否，可疑由培养后试管中指示剂的颜色变化和小套管的气泡的有无断定。指示剂酸性复红。在碱性环境中呈黄色。在酸性环境中呈红色。试验方法：（一）1、培养基：糖类发酵培养基的制备：蛋白胨 10克糖 10克NaCI 5克调PH7.6 1%酸性复红水溶液5ml8磅/英寸2 20分钟灭菌 分装并于试管中倒置一小套管，以收集细菌产生的气体。2、检查方法：（1）取盛有葡萄糖发酵试验培养基的试管三支，一支接种大肠杆菌，另一支接种变形杆菌，第三支不接种。作空白对照。另取乳糖发酵管三支。同样分别接上述两种菌，一支作空白对照，并在各试管上标明菌名和培养基名称，置37培养24小时。（2）观察结果：经培养后，指示剂呈黄色者表示培养基为中性或碱性，呈红色者表示为酸性，同时观察小套管中有无气泡产生。（二）淀粉水解试验某些细菌可以产生水解培养基中淀粉的淀粉酶（胞外酶）。使淀粉水解成麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。其步骤如下：1、培养基：淀粉牛肉膏蛋白胨培养基：可溶性淀粉 2g蛋白胨 5g牛肉膏 3g琼脂 1520gPH 7.27.4 15磅/英寸2 30分钟（1）淀粉培养基在水浴中溶化后，冷至50，以无菌操作制成平板，用接种环取少量枯草杆菌在平板上的一边划“+”字形接种，另取少量大肠杆菌在平板的另一边接种。置37温度中培养1620小时。（2）观察结果：打开皿盖，滴加少量碘液于培养基上，轻轻旋转培养皿，使碘液均匀铺满整个平板。如果在菌落周围出现无色透明圈，说明淀粉被水解，透明圈大小说明该菌水解淀粉能力的大小。（三）乙酰甲基甲醇试验：即VP反应某些细菌生长于葡萄蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，而丙酮酸又可缩合，脱羧而转变乙酰甲基甲醇如加入强碱液即与空气中的氧起作用产生二乙酰，二乙酰与蛋白胨的含羧基成分作用生成红色化合物，称阳性反应，没有红色化合物产生则为阴性反应，VP反应过程如下：试验方法：1、培养基：葡萄糖蛋白水培养基蛋白胨 5g葡萄糖 5g磷酸氢二钾 2g蒸馏水 1000毫升 每管装10mlPH7.07.2 8磅/英寸2 30分钟灭菌2、试剂：VP试剂硫酸酮 1g蒸馏水 10毫升浓氨水 40毫升10%NaOH 950毫升制法：将硫酸铜液于蒸馏水中，然后加入浓氨水，最后加入10%NaOH混合即可。3、步骤（1）取葡萄糖蛋白胨水培养基两支，一支接入大肠杆菌，一支接入产气杆菌，注明菌名，置37培养。（2）培养24小时后取出，加入与培养基等量的VP试剂液，放置37温室30分钟，如呈红色者为阳性，不呈红色者为阴性。（四）吲哚试验某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸而生成吲哚与对二甲基氨基苯甲醛解合，形成玫瑰吲哚，此为红色化合物，其反应变化如下：试验方法：1、培养基：蛋白胨水蛋白胨 10gNacl 5g水 1000毫升15磅/英寸2，灭菌30分钟。2、试剂对二甲基氨基苯甲醛 2g95%乙醇 100毫升浓盐酸 40毫升3、步骤（1）取蛋白胨水培养基试管两支，分别接种大肠杆菌，产气杆菌，并在试管上注明菌明。置37培养43小时。（2）培养后取出，慢慢滴加吲哚剂5滴。有红色环出现者为阳性，黄色者为阴性。（3）也可在培养基中先加入乙酰约1毫升（使呈明显的乙醚层），充分振荡，使溶于乙醚中，静置片刻。使乙醚层浮于培养基的上面。这时再沿管壁慢慢加入吲哚试剂510滴，观察者无红色环出现，注意：加入试剂后不可再摇动，否则被混合。红色不明显。（五）明胶液化试验明胶是一种具有在温水中溶解时形成凝胶性质的动物蛋白质，有些细菌能分泌出蛋白酶（胞外酶）分解此种蛋白，致使失去凝胶性质而没有凝固性，明胶的分解是一种酶促反应，与这一变化有关的酶叫明胶酶，无此酶的微生物则不能被液化明胶。试验方法：1、培养基：明胶培养基：牛肉膏 5g蛋白胨 10gNacl 5g明胶 120g蒸馏水 1000毫升PH 7.27.4 8磅/英寸2，灭菌30分钟。2、步骤（1）取明胶高层培养基三管，分别接种大肠杆菌、枯草杆菌、一管作对照。（2）置20温箱中培养25天，观察明胶液化情况及液化形状。（六）硝酸盐还原试验有些细菌具有硝酸还原能力，将硝酸盐还原为亚硝酸盐或氨或氮等，当加入格星斯氏试剂后。亚硝酸盐与其中的醋酸作用生成亚硝酸。亚硝酸与氨基苯磺酸作用成为重氮苯磺酸。后者与2-萘胺结合成的。硝酸盐还原作用包括如下变化：阴性反应的原理：（1）细菌不能还原硝酸盐，培养后的培养液中仍有硝酸盐存在。（2）亚硝酸盐继续分解生成铵和氮。则培养基中没有硝酸盐存在。硝酸盐的存在是否可用二苯胺试剂检查，如果有硝酸盐存在。当向溶液加入12滴二苯胺试剂时，培养液如果呈蓝色反应，则表明培养物中仍有硝酸盐。又无硝酸盐反应。表示无硝酸盐还原作用。如不呈蓝色表示硝酸盐和新生成的亚硝酸盐都右还原成其他物质。故仍为硝酸盐还原阳性反应。试验方法：1、培养基：硝酸盐还原培养基 牛肉膏 3g 蛋白胨 5g 硝酸钠 1g 蒸馏水 1000毫升 PH 7.27.4 15磅/英寸2灭菌30分钟2、试剂：格里斯氏（Griess）试剂： 溶液1：磺胺酸（对氨基苯磺酸） 0.5g 30%醋酸 150毫升 保存于棕色瓶中 溶液2：称取a-苯胺0.5溶于20毫升蒸馏水中，然后徐徐加入浓硫酸100毫升，保存于棕色瓶内。 二苯胺试剂： 称取二苯胺1g，溶于20ml蒸馏水，然后徐徐加入浓硫酸1001ml，保存于棕色瓶内。 3、步骤： （1）分别接种大肠杆菌、枯草杆菌，变形杆菌于硝酸盐液体培养基中。每菌株作两个重复。另外留两管不接种作对照。试管上注明菌名。置37培养4896小时。（2）取两支干净的空试管。倒入少许培养4896小时的培养液。再滴格里斯试剂，在对照中同样加入A、B液各一滴。（3）观察结果当培养液中A、B液后溶液如变为粉红色。玫瑰色、橙色、棕色等表示有亚硝酸盐存在。为硝酸盐还原阳性，如无红色出现，则可加12滴二苯胺试剂，此时如呈蓝色反应，则为阴性反应，如不呈蓝色反应，则仍为阳性反应。结果与思考：1、细