构建重组质粒基本方法.doc

构建重组质粒基本方法1. cDNA编码区片段的PCR扩增50ul 2模版 15引物 1 3引物 1dNTP 110buffer 5Taq 1Milliq H2O 402PCR产物纯化1、 加5倍体积的PB2、 将Spin柱放于2ml收集管上3、 加样液，14Krpm，离心1min4、 弃去排出液5、 加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min6、 弃去排出液,14Krpm,离心1min7、 将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中8、 往Spin柱的膜中央加入50l的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm，离心1min3双酶切载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul，37，酶切n小时）：载体10ulPCR产物20ul10x buffer3ul10x buffer3ul100xBSA0.3ul100xBSA0.3ul酶11ul酶11ul酶21ul酶21ulMilliQ H2O14.7ulMilliQ H2O4.7ul4双酶切后的载体用试剂盒割胶回收1. 割胶并称重，加3倍体积的QG（胶块每100mg约合100l的体积）2. 50，恒温10min，等到胶完全被溶解3. 将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中4. 加样液，14Krpm，离心1min5. 弃去排出液6. 加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min7. 弃去排出液,14Krpm,离心1min8. 将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中9. 往Spin柱的膜中央加入50l的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm，离心1min5 连接上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4 DNA连接酶作用下16连接过夜。连接体系如下：载体 2ulPCR 片段 6ul10xT4 buffer 1ulT4 DNA ligase 1ul6 转化取上述连接液5l转化到预先制备的DH5化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42热激2min,置冰上5min，加入1mlLB培养液37摇床45min，离心5000rpm，1-5min（不要离心太久，以免太实），最后均匀涂布在含有100 ng/ml抗生素的LB平板上（100-150 ul）。将平板在37倒置培养过夜。挑取阳性克隆菌落转划到另一块含有100 ng/ml抗生素的LB平板上，并对之进行编号，37倒置培养过夜。7菌落原位PCR挑取转划后长出的阳性克隆菌落，加入3ul细菌DNA提取液破细胞。将细菌裂解液作为PCR模板，其他PCR组分及PCR条件同上。PCR产物在2%凝胶上进行电泳分析。8. QIAGEN试剂盒抽提质粒1) 用1.5ml管离心收集细菌，两次，共3ml左右。2) 加入250ul的预冷的P1，打匀后在震荡仪上高速震荡1min。3) 加入250ul P2，温和颠倒数次混匀。4) （在5min内）加入冰上预冷的溶液 N3 350ul，迅速温和颠倒混匀，至出现分散的絮状沉淀。5) 冰上静置2min后离心，13，000rpm，10min。6) 小心吸取上清于蓝色的spin柱中（勿吸到沉淀）7) 离心13，000rpm，1min，弃流出液8) 加入750ul PE，离心13，000rpm，1min，弃流出液9) 再离心一次，离心13，000rpm，1min，弃流出液。以让管内彻底干燥。10) 将spin柱拿出，置于一干净的1.5ml管中，小心的在spin柱中央加入