Southern blot(自总结2).doc

Southern blot （J 版）1. 提取植物总DNA (CTAB法)试剂：1) 2CTAB提取缓冲液（低于15会析出，加入材料前先65预热）0.1 mol/LTris-Cl (pH 8.0)1.4 mol/LNaCl20 mmol/LEDTA (pH 8.0)20 g/LCTAB （2%） 20g/L PVP-40（2%） 使用前加入2% (体积比) 的巯基乙醇。步骤：1) 提取前将植物材料在暗处放置24小时，以降低材料的淀粉含量。2) 剪取大约1g 叶片，置于研钵中，倒入液氮研成粉末（一定研磨细致，非常重要），分装入2ml离心管中（样品约占0.5ml的体积），每管加入900ulCTAB提取缓冲液，温和彻底的混匀，静置，使裂解彻底。3) 65水浴保温1-1.5小时。4) 冷至室温后加900ul 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分温和混匀直到叶片粉末由绿转白（水相，酚相混匀成乳状液）。5) 室温下13,000 rpm离心10 min，吸取上层水相。6) 取上清（约900ul）再用等体积的 氯仿：异戊醇 (24：1)再抽提一次。 13,000 rpm离心10min。7) 取上层水相（约700ul），加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA。小心倒出每管中液体，将絮状DNA沉淀收集到一个新的1.5ml EP管中（同一个样品）。8) 用70%乙醇洗涤沉淀3-5次，每次将沉淀适当浸泡以充分洗涤，最后一次稍加离心，将洗涤液尽量去除干净，通风橱中晾干约10min左右（不要过分干燥）。9) 加200ul灭菌的去离子水（或者TE），并加入2ul Rnase A（10mg/ml）， 37保温30-60min溶解沉淀，充分混匀，并消化RNA。（可直接到第11步）10) （可省步骤）如需做此步骤，则上步中需用700ul ddH2O溶解沉淀，37保温消化RNA后再用等体积氯仿：异戊醇 (24：1)抽提，并离心，取上清。加入1/10体积的NaAC（3M，pH5.2）和2-2.5倍体积的无水乙醇，-20沉淀30min-1hr，10000rpm离心10分钟。70%乙醇洗涤沉淀3-5次，干燥，用200ulTE溶解沉淀，4溶解过夜。11) 取2ul走0.7%的琼脂糖凝胶，检测所提DNA的质量。（上样DNA需要充分混匀）12) 电泳同时可用紫外分光光度计测量DNA的纯度，浓度（仅参考）。13) 选取有代表性的2-3个DNA样品（即电泳显示浓度最大和最小的样品），稀释10倍后用精定量marker进行电泳定量。A260/A280=1.8A260/A230=2-2.52. 制备地高辛标记探针（详见kitII P9）试剂：double distilled water(ddH2O)：稀释DNAEDTA(0.2M， pH8.0 )：终止标记反应DIG-High Prime (kit)：瓶1，防止反复冻融（-20保存）A. 目的基因探针标记(随机引物法)：20ul体系(1) 1ug (至少300ng)模板DNA，用无菌ddH2O稀释到16ul。(2) 沸水浴煮10min，立即放入冰中。(3) 混匀DIG-High Prime （瓶1），加4ul到变性DNA中，混匀，稍加离心。(4) 37 反应过夜（约20小时）。(5) 加入2ul 0.2M EDTA（Ph8.0）或65 10min 终止反应。B. Marker探针标记 (随机引物法)：取3ug lDNA/HindIII Marker，用无菌水将体积补到16ul，沸水浴中煮10min，立即放入冰中。其他同上。探针标记效率的评估（对探针定量）：（Kit P12）试剂：l Washing buffer：洗去未杂交的抗体l 马来酸 buffer：稀释封闭液l 检测buffer（pH9.5）：调节pH值l 10Blocking solution（kit ，瓶6） ：用马来酸 buffer稀释到1。（现配现用）l Antibody solution（kit）：每次使用前需要将anti-digoxigenin-AP（瓶4）以10000rpm离心5min，然后小心从上层取需要量，用blocking solution以1：10000的比例稀释。eg.可取1ul稀释到10ml。直接检测方法估计探针标记效率：一系列稀释度的DIG标记探针直接点在膜上，同时一系列已知稀释度的DIG标记的对照探针也点在膜上，通过标准检测过程显示出来。（具体操作步骤见Kit）3. 酶切 植物总DNA的用量一般为5-15 mg （例如水稻约为5ug, 兰花和烟草约为12-15ug），选用在目的基因内无切点或有单一切点的酶进行酶切。同时切质粒作为正对照，切未转基因的植物材料的总DNA作为负对照。1) 酶切体系(以EcoR I切为例)：切200ul体系 总DNA 150ul (5-15ug) H2O 22ul buffer H 20ul EcoR I 8ul 37酶切过夜(8-12h)。2) 取2ul电泳检测酶切结果。酶切完全的DNA应呈均匀的弥散状。（切记！）3) 酶切完全后加水，将体积补充到600ul，加600ul 24:1的氯仿:异戊醇抽提，13,000 rpm 离心5 min，取上层水相。4) 加入1/25体积 的5M NaCl，2倍体积无水乙醇，20沉淀两小时以上（或者过夜）。5) 13,000 rpm （最好4）离心10 min，70% 乙醇洗涤沉淀，抽干。6) 用30ul水溶解沉淀。4. 电泳、转膜试剂：溶液成分配方3M NaAC, pH5.2NaAC49.218g NaAC + H2O调节pH至5.2定容到200ml2M NaOHNaOH400ml H2O + 40g NaOH定容到500ml5M NaClNaCl400ml H2O +146.1g NaCl 加热助溶 定容到500ml 灭菌1M Tris-Cl, pH7.5Tris, HCl800ml H2O +121.1g Tris + 浓HCl 65ml 1M HCl调pH至7.5 定容到1L 灭菌（应使溶液冷至室温后，方可最后调定pH）变性液(Denaturation solution)0.5M NaOH1.5M NaCl2M NaOH 100ml5M NaCl 120mlH2O 180ml中和液(Neutralization solution）0.5M Tris-Cl, pH7.53M NaClNaCl 70.13g1M Tris-Cl, pH7.5 200mlH2O 定容至 400ml20SSC3M NaCl0.3M 柠檬酸钠pH7.0800ml H2O +175.3g NaCl + 88.2g柠檬酸钠 用NaOH调pH至7.0 定容到1L 灭菌1M HClHCl17.24ml 浓HCl + 182.76ml H2O0.2M EDTA, pH8.0EDTA5.845g EDTA用NaOH调pH至8.0 定容到100ml50TAE (Tris-乙酸)Tris-碱冰乙酸EDTATris-碱 242g冰乙酸 57.1ml0.5M EDTA, pH8.0 100mlH2O 定容至 1L步骤：1) 用30 ml 水溶解酶切后沉淀的DNA，65水浴保温10min，立即放到冰上。2) 冷却后上样品，走0.8% 琼脂糖凝胶（进口琼脂糖），恒压60V电泳34小时，电泳槽周围加冰。样品lDNA/HindIII Marker质粒正对照未转基因负对照转基因材料上样量35ng5ng5-15ug5-15ug3) 溴酚兰距加样孔6-8 cm左右时停止电泳。切掉加样孔及多余的胶，切掉左下角作标记。4） 将凝胶浸入200ml, 0.25 M HCl中进行脱嘌呤处理约5-10 min (若检测条带都小于10kb，可省此步) 。5） 将凝胶取出在去离子水中漂洗一下后，浸入变性液中, 215 min6） 将凝胶取出，在去离子水中漂洗一下，然后浸入中和液中, 215min。7） 将凝胶取出在去离子水中漂洗一下后，进行毛细转移。8） DNA的毛细转移：大培养皿中盛20SSC 上架玻璃板 玻璃板上铺厚滤纸 赶气泡 将凝胶加样孔朝下放在滤纸桥上 周围用Parafilm膜盖住 胶上放等大的尼龙膜 赶气泡 膜上放四层与膜等大的滤纸 赶气泡 上放10 cm厚的纸巾 放玻璃板 上压500 g重物。 9） 毛细转移24 h，取出膜在2SSC中洗一下，夹于滤纸中，80烤膜2 h。5. 杂交:探针使用浓度杂交液杂交温度DNA25ng/ml标准杂交液68标准杂交液50%甲酰胺37-42RNA100ng/ml标准杂交液50%甲酰胺50试剂：溶液成分/用途配方DIG Easy Hyb (Kit)杂交液将64ml 灭菌dd H2O分两份小心加入DIG Easy Hyb Granules（瓶7），立即在37下搅拌约5min使其溶解。10% SDSSDS80ml H2O + 10g SDS 加热助溶 定容到100ml（用0.22um孔径的滤膜过滤除菌）步骤：1）预杂交：将膜浸入预热到杂交温度的（65）DIG Easy Hyb中（10ml /100cm2膜），在杂交箱中65 ，60 rpm，预杂交至少30min（可延长到1h）。2) 将DNA探针（约25ng/ml DIG Easy Hyb）在100变性5 min后，立即放到冰上，冷却2 min。4) 将变性的DNA探针加到预热的（65）DIG Easy Hyb中（3.5ml /100cm2膜），轻柔混匀，避免泡沫。5) 倒掉预杂交液，将杂交液倒入杂交瓶中，65，60 rpm，杂交1216小时。6) 杂交结束，回收杂交液，20可保存1年，再用时68加热10min重新变性探针。 6. 洗膜：1）低严谨性（高盐，低温）：充足的2SSC0.1% SDS，室温 60 rpm 洗涤25 min。2）高严谨性（低盐，高温）：0.5SSC0.1% SDS（预热到洗涤温度），60 rpm 洗涤215 min。注：如果探针150 bp 且G/C% 较高，应当在68洗膜；短于100bp时，洗涤温度同杂交温度。7. 检测：应用化学发光检测法，所有操作都在室温进行步骤：1）杂交结束并洗膜后，在Washing buffer中短暂冲洗膜约1-5 min。2）在80ml Blocking solution 中封闭30 min。（轻摇）3）在20ml Antibody solution 中反应30 min。4) 转移膜入新容器，用Washing buffer 洗两次，每次15min。5）在20ml Detection buffer 中平衡2-5min。6）将膜DNA面朝上小心放入杂交袋中，吸取1ml CSPD ready-to-use（Kit瓶5）均匀应用到膜上，立即将杂交袋的上层盖在膜上，使底物均匀布满膜表面，并且避免气泡产生。 室温反应5min 。7）挤出多余液体，将杂交袋的边缘封住。（防止膜干燥）8）将膜放在37 ，10 min ，以强化发光反应。9）曝光X-胶片15-25min，观察结果。7. 检测：应用化学发光检测法，所有操作都在室温进行试剂：溶液成分配方1M马来酸马来酸（maleic acid）400ml H2O +58.04g maleic acid 定容到500ml（65助溶）马来酸Buffer0.1M maleic acid0.15M NaClpH7.5 (20)1M maleic acid 100ml5M NaCl 30ml H2O 870ml用固体NaOH调pH至7.5（要仔细，易调过）Washing buffer0.1M maleic acid0.15M NaCl0.3% (v/v) Tween 20pH7.5 (20)1M maleic acid 100ml3M NaCl 50ml Tween 20 3mlH2O 847ml用固体NaOH调pH至7.51M Tris-Cl, pH9.5Tris, HCl400ml H2O + 60.5g Tris HCl（浓HCl约3ml左右）调pH至9.5 定容到500ml 灭菌Detection buffer100mM Tris-Cl, pH9.5100mM NaCl1M Tris-Cl, pH9.5 50ml5M NaCl 10mlH2O 415ml3M NaClNaCl40