植物体内沉默基因的表达.doc

激活微生物体内隐藏天然产物的生物合成Kirstin Scherlach and Christian HertweckTranslated from The Royal Society of Chemistry 2009.7摘要：微生物体产生的天然产物是新型药物的重要资源，但在标准实验室条件下培养微生物时，仍未发现更多由沉默基因编码的有价值化合物，在特殊条件，能激这些活隐藏基因或沉默基因。本文综述了采用生物合成途径激活合成隐藏天然产物的途径，包括外部条件诱导、共培养及基因组方法，如基因组挖掘、表观遗传修饰及工程途径激活。引言天然产物药物在各种疾病的治疗中一直发挥着重要作用，次级代谢产物是新型治疗剂和药物先锋，尤其是作为免疫抑制剂，或应用于对癌症、传染性疾病及脂肪代谢紊乱的治疗。天然产物是调节病原菌的毒性因子和解释生物学靶标的重要工具，源于自然界的天然产物的特点是它们多样的独特结构，说明它们的开发潜能、选择性及固有的绑定蛋白质折叠特性。 开发微生物天然产物的常用传统方法包括采样、培养菌株、提取、活性筛选及结构确定，这些方法常因为较高的重复率而失败。但对微生物基因组的不断研究为天然产物生物合成的原理提供了宝贵依据，同时为发现和合成新型化合物提供了很好的供选方案。在微生物体内，编码次级代谢产物生物合成的基因是成簇的，这个发现利于后续研究。且已对控制两大类天然产物生物合成的PKS和NRPS途径进行了深入研究。近来基因组测序工程已发现采用传统开发方法，微生物体的生物合成潜力有待大力开发，实际上在各种细菌和真菌中，编码生物合成酶的基因组数量已明显超过了生物体已知的次级代谢产物，其中一个原因可能是仅表达了编码生物合成酶的少部分基因 ，因此只产生少数化学结构，这些沉默基因以“隐藏的”或“孤立的”的方式存在，需通过诱变来激活假定的编码潜在生物活性结构的基因。但并不是所有沉默基因都是必须的，由于产率低、大量的代谢背景及不利的培养条件等原因，导致仍未发现相应的代谢产物。因此，微生物次级代谢基因组的系统研究可能代表着向微生物体天然生物合成能力探索的第一步。一 改变培养条件、外部刺激及渗透压来开发微生物资源我们已经知道在发酵学发展的初期，对微生物刺激代谢产物的数量起关键作用的是培养限制性因素，即便是培养基的微小变化，不仅会影响到某种化合物的数量，且会影响到微生物体产生一般代谢产物的范围（如图1）。尤其是在抗生素领域，已在生产率和产物范围的最优化方面做了很多研究。控制营养和环境因素能促进次级代谢产物的生物合成，也利于新型天然产物的发现。Zeeck和他的同事们已阐述了提高微生物代谢产物的发酵参数，并为此方法创造出专业术语“OSMAC”（一株菌株多种化合物的意思）。通过改变易受影响的培养参数，例如培养基组分、通风状况、温度及培养皿的形状等，上述参数的改变可能在真菌和放线菌中筛选到新型天然产物。现有研究已发现此菌株在传统培养条件下仅能产生一种酮类化合物，但在不同培养条件下培养赭曲霉菌株，结果产生了15种天然产物。培养条件、外部化学诱导及渗透压因子对天然产物生物合成的影响；这些影响因子激活沉默基因，使其表达出新型代谢产物。Fig. 1 Influence of culture conditions, external (chemical) cues, and stresson natural product biosynthesis.Paranagama等采用类似方法研究两种植物共生菌的次级代谢产物，在制备培养基时用蒸馏水代替自来水，即诱导产生了6种新的代谢产物；培养毛壳菌属菌株时，将固体培养基变为液体培养基，代谢产物由根赤壳菌素7变为毛壳色菌素A 8。同时对影响次级代谢产物生物合成的各种培养条件和压力条件的变化进行了深入研究。由产生球番石榴素的球壳孢菌经紫外诱变得到的菌株真菌F24 201y，在肉汤培养基中化学筛选时，发现了14个大环内酯类化合物。三环唑是DHN生物合成抑制剂，能抑制球壳孢菌素的产生。此真菌在补充有三环唑的培养基中培养时，仍会产生相同的化合物。结果表明：酶抑制剂会影响生物合成途径的激活。Ayer等人在几年前报道了杰多霉素B 10的分离，杰多霉素B 10是链霉菌ISP5230经热激后产生的一种糖基化抗生素，37条件下，在含有半乳糖-异亮氨酸的培养基中产生的代谢产物是含有糖苷配基的杰多霉素；当温度升至42时，代谢产物是杰多霉素B。后续实验揭示了更一步的影响参数，正如乙醇处理和噬菌体侵染，短时间的热激能产生更多的杰多霉素B。最近发现杰多霉素B是激光激酶B的抑制剂，因此，杰多霉素B很有希望成为新型抗癌药物。Crews等向培养基中添加了药效较大的F-肌动蛋白抑制剂后，从芦笋茎枯病菌中分离得到三种新的球毛壳菌素类似物。在实验室中缺乏微生物产生代谢产物的条件下培养微生物时，应该考虑到微生物的特殊环境条件要求。Overy等尝试模仿真菌生长的天然环境，在浸透过的寄主组织中培养了几株死物寄生的青霉菌，结果产生了伞房花素14和伞房花素内酯物15-18，这也许提示了在死体营养植物或病原菌环境中，这些代谢物的影响作用。为达到分离发酵真菌的最佳培养条件，Bill等采用小型化平行微板发酵，发现大量真菌筛选的培养条件是多样化的，即真菌的营养库。分离化合物需要提高发酵效果，此方法应用受到生物活性初步测定的限制。二 共培养条件下的种间干扰产生新型代谢产物 已对微生物体天然代谢产物的功能作用进行了深入研究，尤其是在微生物群体或种间关系等复杂环境条件下次级代谢产物的研究成为热点。天然产物由生物体与环境之间的相互作用产生，特别是在同种或异种生物之间的相互影响下，产生了大量不同的天然产物，例如信息素、捕食系统分子及共生关系的代谢物等（如图2）。产生多种化学物质的种间干扰方法已应用于实验室。Fenical等研究了混合发酵能否产生新型代谢产物，他们将海洋生物盘多毛菌和一种未知的且抗抗生素的海洋细菌共培养时，生物合成了一种新型苯甲酮物质盘多毛菌素19，具有较强的抗细菌活性，能抵抗黄色葡萄球菌的新青霉素抗性和肠球菌的万古霉素抗性，但当两菌株单独培养时，不能得到此活性物质。 Fenical 等发现在竞争性共培养条件下培养的海洋微生物埃默里克菌株，得到两种新型缩酚酸肽产物。嗜盐放线菌与真菌在竞争性培养条件下共培养，天然产物埃默里克菌素A 20和B 21的产量增加了100多倍，且得到了这些化合物的结构。近来采用基因敲除方法得到了埃默里克菌素的生物合成的基因，为合成新的结构类似物提供了依据。微生物体之间的化学信号及物理干扰激活沉默基因表达化学信号交换：生物体产生激活沉默基因表达的信号分子Fig. 2 Possible routes for secondary metabolite biosynthesis in mixed cultures: (A) One organism stimulates assembly of natural products in the other organism via secretion of chemical signals or physical interaction; (B) Exchange of chemical signals: One organism induces biosynthesis of signaling molecules which then stimulate production of cryptic metabolites2006年，Angell等报道了另一种生物体协同作用产生代谢产物的事例，他们发现在培养来自海洋底部沉积物中的混合细菌时，产生了具有抗生素活性的蓝色染料，经X-射线、1D及2D的NMR等化学分析，得知结构与绿脓菌素22一样是吩嗪类衍生物。对起始混合菌中的单个细菌进行培养时，并没有产生蓝色染料。因此认为微生物间的相互作用对于刺激绿脓菌素的形成是必需的。他们通过大量实验证明微生物种间结合作用的重要性，绿脓假单胞菌和肠杆菌是混合菌中的一对，其中绿脓假单胞菌是抗生素真正生产者，而肠杆菌为诱导菌。在几株绿脓假单胞菌中发现绿脓菌素的合成是由特定序列调控的，表明种间干扰也涉及到小分子，使用Boyden小室的连续培养实验证明了此假设。为确认生物种间是否存在特定干扰或任何微生物都能诱导绿脓菌素的形成，将绿脓假单胞菌与其他微生物共培养，发现另外一种肠杆菌也可作为激活体，且结果表明分离得到的绿脓假单胞菌已经失去了自我激活产生绿脓菌素的能力，刺激信号有肠杆菌代替提供。Watanabe等通过研究吩嗪类代谢物作为氧化应激诱导剂的作用时发现了其初级生物效应。对细菌通信系统的大量探索为新型代谢产物的研究提供了依据。研究已表明小信号分子在几种细菌产生抗生素中起着重要的调控作用，例如 A因素在灰色链霉菌产生链霉素时是必须的，而-丁内酯控制维及霉素、最小霉素及防线菌紫素的形成。由灰色链霉菌产生的一种肽内酯霉菌素，不仅影响气生菌丝的生长，而且抑制次级代谢产物的形成。Takano等已研究了能否在实验室中利用细菌通信系统诱导次级代谢产物的形成。三 基因组方法：从电子杂交预测到基因工程方法上述各种关于新型天然产物生物合成的方法在很大程度上依赖于适宜的培养条件，即让沉默基因在实验室培养条件下表达。但从全序列基因组中检测次级代谢基因组和目前所检测到的天然产物数量之间的差异，我们可以推测大部分基因或缺乏表达，或仍未发现相匹配的物理、化学刺激方法来激发沉默基因的表达。为充分利用资源，可尝试采用以下方法。（一） 激活新型天然产物生物合成的基因将抽提文库的化学筛选方法与基因组向导方法相结合，已经成为开发新型天然产物的有力工具，由沉默基因位点编码的假定化学结构的电子杂交预测，则能直接搜索到相关代谢物。Zazopoulos等为得到合成抗癌物质的假定基因，对几株放线菌进行了分析，最终发现适宜的培养条件能激活假定基因的表达，产生了炔二炔类物质。McAlpine等为得到I型PKS基因，扫描了放线菌基因组，预测聚酮类化合物的紫外吸收峰为300nm。培养条件的变化能激活目标化合物的生物合成途径。在生物合成基因簇分析的帮助下得到ECO-02301 23的化学结构，并由分光镜技术确认。对与植物共生的荧光假单胞菌属Pf-5进行分析，发现了一个沉默杂合子PKS-NRPS基因组，且与近来发现的根瘤毒素的生物合成基因组具有高度同源性。根瘤毒素是由伯克霍尔德菌内生真菌中克隆得到，与普通想法不一样的是：毒素是由伯克霍尔德菌内生真菌产生，而不是由真菌寄主小芽孢酒曲霉产生的。因基因簇具有同源性，已将荧光假单胞菌Pf-5生物合成根瘤毒素的能力进行了深入研究，在各种生长条件下检测其代谢谱，产生多种结构相关联的根瘤毒素复合物抗生素类物质来肯定其假设。基因组和分析结合的方法能发现新的真菌代谢产物。为得到假定生物合成基因簇，对巢形曲霉的全部基因组序列进行扫描，发现至少存在三个基因拷贝，它们编码的蛋白质可能是具有高度同源性的氨基苯甲酸合酶（ASs）。众所周知，氨基苯甲酸合酶催化分支酸盐转化为氨基苯甲酸是色氨酸生物合成的关键步骤。但是假定编码氨基苯甲酸合酶的基因存在大量拷贝，证实了其中一些基因的产生可能与次级代谢途径相关联的推断。氨基苯甲酸是生物碱的前体物质，尤其是在喹啶啉、喹啉衍生物及吖啶类生物碱的合成中，研究发现巢形曲霉主要产生了含氮的次级代谢产物，在几个检测到的培养基中发现在一含有米饭的固态发酵培养基中产生了四种新的喹啉类生物碱。（二）编码次级代谢产物的基因组的表观遗传修饰最近已报道了关于引发真菌天然产物生物合成的新方法。在曲霉中，核转录调节子Lae A控制次级代谢产物的产生，核转录调节子的发现说明了普遍调控机制的存在,可利用真菌的调控机制来确定在某个生长阶段或是在特殊环境条件下次级代谢产物的大约产量。研究表明，像组氨酸去乙酰化酶和DNA甲基化酶一样，真菌基因的转录调控由表观遗传修饰调节子完成。Keller等将编码巢形曲霉组氨酸去乙酰化酶(HDAC)的基因(hdaA)敲出，而激活了次级代谢产物基因簇的转录。用组氨酸去乙酰化酶(HDAC)抑制剂处理其他真菌，同样会大量产生几种代谢产物。采用表观遗传修饰来启动代谢产物的生物合成：表观遗传修饰可抑制组氨酸去乙酰化酶和DNA甲基化酶的活性。Fig. 3 Triggering secondary metabolite biosynthesis by epigenetic remodeling; Epigenetic modifiers inhibit DNA-methyltransferase (DNA-MT) and histone deacetylace (HDAC).Cichewiczand等假设采用表观遗传修饰来合理调节次级代谢产物的产量（如图3）。在预试验中，它们在一系列稀释梯度下，用几种DNA甲基转移酶与组氨酸去乙酰化酶(HDAC)抑制剂处理12种真菌，其中有11株菌作出了反应。正如代谢谱的研究结果一样形成了新的或积累量更高的天然化合物。对其中两株菌进行了更为深入的研究，在分枝孢子菌的培养基中加入5-氮胞苷，产生几种羟酯类物质（29-31）；用异羟酯酸处理后得到两种新的茈醌类物质（32-33）及四种已知的分枝孢子菌素（34-37）和B 38。有趣的是这些化合物中的两种（分枝孢子菌素A34和B35）是黄瓜幼苗感染枝孢属的产物，且不能在单独培养发酵中得到。另一个研究的是座壳种，5-氮胞苷引发形成了两种新的聚酮类化合物，月亮霉素A 39和B 40。近来他们通过鉴定曲霉的一个沉默代谢物基因来表明化学表观遗传修饰的开发潜力，在补充有异羟喹酸的真菌培养基中仅产生A 41。（三） 激活特有的调控基因途径另一个更具有意义的方法是激活特有的调节基因（如图4）。目前，这些编码假定激活蛋白的基因存在于次级代谢基因簇中，它们的大量表达可能引起所有通路基因的协同表达。这个方法的优点是仅需要处理一个小基因和异源整合就足够了，从而避免了同源重组的所有限制，最近已报道了这个技术的成功应用。为挖掘巢形曲霉菌产生代谢产物的隐藏基因而进行的研究表明：正如没有产生和鉴定对应的天然产物，假定杂合PKS-NRPS基因存在。在标准发酵条件下，已假定的基因位点是沉默的，但在基因簇中，假定基因处于激活状态，这个基因在可诱导型启动子的控制下大量同源表达，从而激活整个生物合成途径。在诱导和非诱导条件下，转化菌株的代谢谱表明产生了新型代谢物，按比例增加的发酵能形成两种新的吡啶酮类生物碱（A 42和B 43）。这个方法也许能使用于其它沉默的基因簇的激活，因此说明此技术是开发新型天然代谢产物比较有价值的新选择。用诱导型启动子构建的基因来激活沉默基因表达，产生目标代谢产物。Fig. 4 Triggering natural product biosynthesis by activation of pathway specificregulatory genes（四） 沉默生物合成基因的异源表达研究已表明将沉默基因的片段或部分转移到异源寄主中，对于诱导沉默基因的表达和形成新型天然产物是一种非常成功的方法（如图5）。但此方法的应用中存在一些限制，如在处理大量基因簇或找到合适的寄主时存在困难。特别是在真菌中，生物合成酶的不同产量是很繁琐的，极其需要替换或补充技术。克隆沉默基因转到异源寄主中表达，形成新型天然代谢产物。Fig. 5 Harnessing the biosynthetic potential by heterologous expression四 结论为满足现代药物不断增长的需求，仍需要新型化学结构，特别是长期使用抗生素而产生的细菌抗药性，对药物开发过程起到重要的推动作用。为避免利用现存方法开发天然产物的限制性问题，我们不得不寻找替换途径。对生物合成机理的深入研究，让基于基因组的新方法来弥补传统方法中的不足。对次级代谢产物在生物体天然栖息环境中所起作用的研究似乎是个很好的方法，对天然产物功能研究的越透彻，就能更好的开发利用微生物资源。自然界中存在大量待开发药物，我们所面临的挑战是找到开发利用生物合成潜力的新方法。激活微生物体内隐藏天然产物的生物合成文献阅读心得：微生物的次级代谢产物是制药工程的重要资源之一，近年来在医学和农学领域的应用更为广泛，抗药性的产生迫使我们加快开发微生物资源的速度，但是微生物新种及新型代谢产物的发现受到实验室培养条件的极大限制。随着生物化学和分子生物学的快速发展，人们研究的方向转移至启动隐藏或沉默基因的表达，这些沉默基因在实验室培养条件下并不能表达，本文综述了几种开发微生物资源较为新颖的方法。一 通过改变培养条件、外部化学刺激、物理干扰及压力因子等来激活沉默基因的表达。同一菌株在不同配方、温度、湿度、培养皿形状的培养基