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文档简介
实验原理DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰,蛋白质在280nm处有最大的吸收峰,盐和小分子则集中在230nm处。因此,可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度,OD值为1相当于大约50g/ml双链DNA。如用1cm光径,用 H2O稀释DNA/RNA样品n倍并以H2O为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:DNA(ug/ml)=50OD260读数稀释倍数。RNA(ug/ml)=40OD260读数稀释倍数。DNA/RNA纯品的OD260/OD280为1.8或2.0,故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA,比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间,若比值较高说明有残余的盐存在.本实验室机器显示是OD260OD230,则比值应在2-2.5之间,偏小则说明有残余盐剩余。实验步骤1. 将制备的DNA悬浮溶解于TE缓冲液中pH8.O, 1Ommo1/L的Tris缓冲液,内含1mmol/L EDTA或悬浮溶解在灭菌水中(依据DNA含量加水)。2. 用可扫描的紫外分光光度计测定制备的DNA/RNA的紫外吸收曲线,测定OD260和OD280,并计算比值:OD260/OD280,纯DNA的此比值约为1.82.0。纯RNA的此比值约为大于2.0。3. 根据:每毫升1微克的纯DNA的OD260值= 0.020,计算所得DNA的纯度;每毫升1微克的纯RNA的OD260值= 0.025,计算所得RNA的纯度;并讨论纯度较低的原因和解决办法。260、320、230、280nm下的吸光度分别代表了核酸、背景(溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的,只看OD260/OD280(Ratio,R)。DNA: OD260/OD280比值应接近1.80,若R值大于1.8。说明存在RNA,可重新用RNaseA处理,酚:氯仿:异戊醇(23:24:1)抽提。若R值小于1.8,则说明有蛋白质等杂质存在,需再用蛋白酶K、SDS及盼、氯仿、异戊醇重新对DNA进行纯化(也可加入1/8体积的3M NaAc(pH5.2)与冷乙醇一同促使DNA沉淀析出。RNA: OD260/OD280比值在1.8-2.0时,认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的,不过要注意,当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时,R值可能会大于2(一般应该是2.2的)。当R2.2时,说明RNA已经水解成单核酸了。注意事项1. 有用品均需要高温高压,以灭活残余的DNA酶/RNA酶。2. 所有试
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