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土壤中反硝化菌的分离与其反硝化能力的分析研究上海交通大学附属中学 高二（9）班 姜北辰 201209232011-2目录1、 绪论2、 实验材料及方法3、 结果与数据分析4、 分析总结与讨论5、 参考文献摘要：通过对土壤样本进行初筛和复筛，以限制氮源的方法分离出8株具有反硝化能力的微生物，对5株微生物的反硝化能力进行测定，其二周时间硝酸盐降解率最高为100%，最低为66.76%。对此8株菌株的DNA进行PCR扩增，引物为已知的nirS和nosZ反硝化基因的相应引物，发现有三株菌株含有nosZ基因。再对此8株菌株中的7株的16S rDNA进行PCR扩增，鉴定菌种。关键词：反硝化微生物，菌种鉴定，反硝化菌筛选1、 绪论：反硝化作用（denitrification）也称脱氮作用。反硝化细菌在缺氧条件下，还原硝酸盐，释放出分子态氮（N2）或一氧化二氮（N2O）的过程。大部分反硝化细菌是异养菌，例如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等，它们以有机物为氮源和能源，进行无氧呼吸，其生化过程可用下式表示：C6H12O6+12NO3-6H2O+6CO2+12NO2-+能量CH3COOH+8NO3-6H2O+10CO2+4N2+8OH-+能量反硝化作用使硝酸盐还原成氮气，从而降低了土壤中氮素营养的含量，对农业生产不利。农业上常进行中耕松土，使土壤与氧气充分接触以防止反硝化作用。反硝化作用是氮素循环中不可缺少的环节，可使土壤中因淋溶而流入河流、海洋中的NO3-减少，消除因硝酸积累对生物的毒害作用。所以我们应尽量发挥其有利的一面，为人类所利用。反硝化微生物对于硝酸根离子的还原步骤如右图，若要从微生物代谢角度验证菌株是否为反硝化菌最简单有效的方法便是测定nirS和nosZ基因是否存在。由于N2O和NO都是温室气体，是否含有nosZ基因对于菌种的用途有着实际且重要的意义，即可以使土壤中微生物代谢产生的N2O和NO还原成氮气1。本实验的目的便是通过筛选土壤中的反硝化菌，测定反硝化能力，鉴定其是否含有nirS和nosZ基因，对此进行综合分析，找出反硝化能力较强的菌株，最终制备纯培养的反硝化菌菌株。实验完成后，此菌株将有十分广大的应用前景。例如，将对农田等生态系统中其他微生物产生的N2O和NO等温室气体还原，减少温室气体的排放，为维持环境的稳定起到积极作用。2、 实验材料与方法（1） LB液体培养基 (每1000ml) 10g蛋白胨 5g酵母提取物 10g NaCl若加入15g琼脂粉则为LB固态培养基成分。（2） TSA培养基：胰蛋白胨0.75g/L大豆胨 0.25g/LNaCl 0.25g/L（3） Giltay培养基A溶液：KNO3 1.0g。天冬酰胺1.0g，1%BTB酒精溶液5mL，蒸馏水500mLB溶液：柠檬酸钠8.5g， MgSO47H2O 1.0g，FeCl36H2O 0.05g，KH2PO41.0g，CaCl22H2O 0.2g，蒸馏水500mL混合A、B溶液，加入1%mol/L的NaOH溶液调节pH为7.1，灭菌备用。（4） 琼脂糖凝胶电泳 全基因组电泳：TAE buffer 30ml琼脂糖0.8%（0.24g） PCR产物电泳：TAE buffer 50ml 琼脂糖1.2%（0.6g） 均加入荧光剂EB 1微升（5） Bead-Beater法所用试剂 bufferZ ：10mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 8.0 (1.21g Tris碱，8.755g NaCl, 加HCl调至pH 8.0, 配成1L溶液) 10%SDS(C12H25OSO3Na)100g溶于1L水 pH 5.3 氯仿-异戊醇（24：1） 苯酚（pH 8.0） 无水乙醇 Eirconium beads Screw tube（6） PCR反应体系(25l) 10buffer 2.5l Taq酶 0.25l MgCl2 2l dNTP 2l primer1 0.5l primer2 0.5l 水 16.25l 模板 1l nosZ nirSprimer1 nosZ F R3cdprimer2 nosZ R cd3aF（7） 修正PCR反应体系（50L） 10buffer 5L Taq酶 1L dNTP 7L primer1 1L primer2 1L 模板 12L DMSO 1L ddH2O 33L（8） PCR反应引物序列及条件目的基因引物引物序列（53）反应条件nirS2cd3aFGTS AAC GTS AAG GAR ACS GG94 for 2min,30(94 for 30s,51 for 1min,72 for 1min),72for 10minR3cdGAS TTC GGR TGS GTC TTG ANosZ3nosZ FCGY TGT TCM TCG ACA GCC AG94 for 2min,3(94 for 30s,65 for 1min,72 for 40s),4(94 for 30s,60 for 1min,72 for 1min),18(94 for 30s,55 for 1min,72 for 1min),72 10minnosZ RCAT GTG CAG NGC RTG GCA GAA（9） 化学转化体系：pMD18-T载体 0.5LDNA 4.5LSolution I 5L载体与Solution I为TaKaRa公司产品（10） 仪器、试剂：普通离心机、冷冻离心机、超净台、恒温培养箱、摇床、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、紫外分光光度仪、PCR仪、凝胶电泳槽、水浴锅、冰浴、金属浴仪、紫外照胶仪、快检器，实验所用化学药品均为分析纯。（11） 初筛：先将土壤样本稀释100倍作为样本。提取样本，稀释为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8六个梯度，各500微升。其中， 10-5、10-6、10-7三个浓度各涂两个平板，其余各涂一个平板。再加上10-2浓度在平板上进行划线，总计10个平板。平板上培养基为TSA培养基。然后将平板放入厌氧培养箱中18培养一个星期。（12） 菌落集中培养：另取一平板，在其背面贴上50格的方格纸，然后从10-6和 10-7的平板上挑取菌体分别接种在每个格子的左上（记为A）和右下方（记为B）。（其上菌落的编号方法：方格号+位置，例：10A、44B）。共计100个菌落。将此平板与先前各平板一道放入厌氧培养箱继续培养一周。此平板记作“平板A”（13） 复筛：使用移液枪头挑取平板A上较明显且较有代表性的10个菌落接种进预先加好Giltay培养基与BTB的大试管内，记下编号，培养一周。接种到大试管中的细菌编号：17A、17B、19A、19B、23A、23B、38B、41A、42A、43A。BTB变蓝的试管编号：17A、17B、19A、19B、23A、38B、41A、43A。将所有平板密封放入冰箱保存，将大试管放入振荡培养箱继续培养。一周后，提取大试管中的培养液，开始测量硝酸盐的降解程度。此时，菌已在大试管中培养三周（28）。使用仪器为紫外分光光度仪，波长为220nm与275nm。记录实验数据，将结果进行数学模型拟合，推算出硝酸盐降解程度。（14） DNA提取与PCR扩增： 配制LB液体培养基100ml，取16个试管，将有反硝化能力的8株菌株接种到试管中，进行好氧培养，16小时后放4保存。 使用煮菌法从平板A上提取DNA，把已知的反硝化基因nirS和nosZ基因为目的基因，使用相应引物，进行PCR扩增，电泳后比对。通过研究比对看具有反硝化能力的菌是否含有这两种基因。 取4保存的菌液使用Bead-beater法提取高纯度DNA。 用此DNA作为扩增16S rDNA的模板，引物为16S rDNA全程引物（27F、1492）。同时使用此DNA对目的基因PCR作复核，重复三次实验。（15） 琼脂糖凝胶电泳（8个菌株的DNA样品+阳性对照+阴性对照）使用30ml规格0.8%的琼脂糖- TAE buffer溶液，取全基因组DNA样品3l，无菌水2l，缓冲液1l在塑料膜上点样混匀后注入凝胶的孔内，电压80V。使用50ml规格的琼脂糖- TAE buffer溶液，取PCR扩增DNA样品3l，无菌水2l，缓冲液1l在塑料膜上点样混匀后注入凝胶的孔内，电压120V。结束后放入暗箱内拍照，比对。（16） 16S rDNA电泳产物的割胶回收制备回收胶，紫外灯下割取明亮条带于1.5ml Ep管中。使用OMEGA公司的DNA回收试剂盒回收16S rDNA。（17） 使用OMEGA公司的DNA回收试剂盒回收16S rDNA 称胶重 加适量Binding buffer(XP2) 放入60水浴10min使胶融化。 组装DNA column和2ml 收集管 加入700l样品，1000g离心1min 倒去液体加700l Binding buffer(XP2) 重复一次1000g离心1min 最大转速空转2min，放65烘箱5min 加DNA洗脱缓冲液50l，1000g离心1min（18） 化学转化 取感受态大肠杆菌细胞（DH10B），放冰上融化。 配制10l体系（T载体0.5l，solution I 5l，样品4.5l） 加入转化体系后，冰上放置30min 42热激90s 放冰上23min 加入1ml LB，37 1小时培养 涂布在加Amp的固态LB上，培养16小时。 Amp固态LB成分：Amp 250l, IPTG 80l, Xgel 320l（19） 质粒快检 挑取平板上的白色菌落另取平板培养。 在1.5ml EP管中各加入40l快检液I（50l 10mmol/EDTA pH 8.0） 用枪头刮取菌体于EP管中，充分震荡 各加入20ml快检液II 65烘箱 15min 加入10l快检液III（酸酚）充分震荡，12000rpm 5min 取上清5l点样电泳3、 结果与数据分析（1） 初筛方法所得出结论：在反硝化微生物的厌氧培养涂布平板中，样本稀释倍数以10-6与10-7浓度最为合适，此时菌落数从10个到50个不等。一周后长出菌落直径12mm，两周后长出的菌落直径为34mm，菌落形态十分容易辨别。（2） 复筛结果：共挑取有代表性的十株菌株接种至加Giltay培养基与BTB的大试管中，一星期后，十个试管中有八个变色，记录其编号。在平板A上观察变色的八个菌落形态，得出以下数据：表一：菌落形态编号大小形状边缘厚度颜色透明度17A大不规则光滑较薄黄半透明17B小圆形光滑较厚黄半透明19A大不规则光滑较厚黄半透明19B大不规则光滑较厚黄半透明23A大不规则粗糙较薄白半透明38B大不规则光滑较厚黄半透明41A小不规则粗糙较薄白不透明43A大不规则粗糙较厚白不透明（3） 使用紫外分光光度仪进行硝酸盐降解程度的测定，紫外光波长为220nm和275nm，此时已培养两周时间。以菌落形态有代表性为标准，测定了8个菌株中的5个，得出以下数据：表二：8个菌株中5株的吸光度实测值吸光度实测值A220A275A校正（A220-2A275）原液0.3870.0080.37117A0.3530.0910.17117B0.3300.1640.00219A0.4190.1220.17519B0.4900.1210.24823A0.3520.1460.060对获得的吸光度数据进行处理，得到表三：表三：5株菌株的降解率编号原浓度（mg/l）降解率原液167.28-17A38.0577.25%17B-0.48100.28%19A38.9676.71%19B55.6066.76%23A12.7592.38%分析比较实验数据，发现17B，17A，23A三株菌株的反硝化能力最强。同时发现17B的实验数据存在负值，说明实验存在误差。（4） 关于以16S rDNA基因PCR反应条件的改进：在实验过程中，为了找到扩增菌株样品16S rDNA的最适条件，使用温差梯度PCR仪，设置51、53、55、57、59、61六个梯度为退火温度，电泳后得出以下结果： marker 57 55 61 59 57 55 53 51发现当退火温度为55到57时PCR效果最好，因为此时条带较亮，说明DNA浓度较高，而61明显太高。最终确定16S rDNA的PCR反应条件为：94 for 2min, 30（94 for 30s, 55 for 1min, 72 for 1min）,72 for 10 min, 15 forever。（5） 凝胶电泳结果说明：为了简便标记，将原有菌株重新编号，17A、17B、19A、19B、23A、38B、41A相应更改为1、2、3、4、5、6、7号菌株 nirS与nosZ基因鉴定结果该实验重复四次，第一次PCR扩增失败，第二次出现较多非特异条带。分析实验过程中可能出现的问题，对PCR的反应体系作出修改，见“实验材料和方法（7）修正PCR体系”。第三次与第四次结果相同如图所示。nosZ阳性 7 6 5 4 3 2 1 nirS阳性 7 6 5 4 3 2 1 图片中marker左边为以nosZ基因为目的基因的PCR产物的电泳情况，marker右边为以nirS基因为目的基因的PCR产物的电泳情况，与相应阳性对照比较得出结论：第1、3、4号菌株含有nosZ基因，但没有菌株含有nirS基因。 16S rDNA的电泳结果，如图：marker 7 6 5 4 3 2 11.5kb 16S rDNA的PCR扩增完成后，进行割胶回收，为了为化学转化做准备，对割胶回收产物DNA进行电泳，观察其浓度是否足够。如图所示，5、6、7号菌株回收浓度较低，在化学转化时用上全部DNA回收产物。marker 1 2 3 4 5 6 7 marker 化学转化完成后，在培养16小时的Amp的LB平板上挑取白色菌落每个菌株各6个菌落，接种到新的Amp的LB平板上继续培养，12小时候挑取菌落做快检，同时把菌液加40%甘油放入菌种管中-40保存。快检结果显示仍有少量空质粒存在，丢弃相应菌种管。此图显示，左起第5、7、9列为空质粒。因为空质粒为极个别现象，在此仅显示全部快检结果的一部分。（6） 菌种鉴定结果每株菌株送3管菌液至公司测序，公司为上海英俊生物技术有限公司。对7株菌株样品的16S rDNA测序结果与基因库相比对，得到表四：表四：菌种鉴定结果菌株编号最相似菌种相似度117AAeromonas hydrophila99%217BAeromonas hydrophila99%319AAeromonas media98%419BAeromonas media99%523ASerratia fonticola99%Acinetobacter sp.99%638BAeromonas media99%741ASerratia fonticola99%其中，共分离得到三种细菌，嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、中间气单胞菌（Aeromonas media）、居泉沙雷氏菌（Serratia fonticola）。值得注意的是，5号菌株2个克隆鉴定为居泉沙雷氏菌，但另一个克隆鉴定为不动杆菌属的某种（Acinetobacter sp.），由于此属细菌在自然环境中分布极广，且粘附性强，疑似为菌种管被外源菌污染所致。4、分析总结与讨论本课题较成功地分离出8株反硝化菌株。分析比较实验数据，菌株17B，17A，23A的反硝化能力最强。电泳的结果显示，菌株17A、19A、23A含有nos