生化黄腐酸的研究进程.doc

生化黄腐酸的研究进程张婷瑞 （成都大学生物产业学院，四川 成都 610106）摘要：本文通过对生化黄腐酸研究的发展过程对其提取方法进行了归纳性总结。主要是通过碱溶酸沉的方法提取出黄腐酸。从而得到一种系统提取分析黄腐酸的方法，更好的运用于黄腐酸的制备，提高其提取率。关键词：黄腐酸 生化 提取 前言：腐植酸是一类成分复杂的有机物, 在农业上的应用越来越广泛。开发生产腐植酸类物质的原料一般采用泥炭、褐煤、风化煤等, 得到的腐植酸分子量大、水溶性不好、抗硬水能力差, 且生物活性较差, 因此人们一直在寻求不同的制备腐植酸的资源及制备方法。近十年来, 利用秸杆、木屑等农副产品为原料, 采用生物发酵方法制取黄腐酸类物质的技术, 可称为“ BFA技术”1, 为腐植酸类物质的开发生产提供了新的途径。由于生物发酵法制得的黄腐酸类产品具有良好的性能, 如其缩合程度和碳含量低、分子量较小、含有的活性基团较多、水溶性较好、絮凝极限高、生物活性高等, 因此在农业生产上迅速地得到了推广和应用。但是, 与生产和应用的热烈局面相比, 对技术本身的研究和开发却显得比较冷清, 至今对生化黄腐酸类产品既没有明确的界定, 也没有统一的检测方法和质量标准, 对其生产工艺条件也缺乏必要的优化, 这种状况显然不利于BFA技术的健康发展。1黄腐酸类物质概述11腐植酸的来源及分类腐植酸(Humic Acid，简写HA)是一类成分复杂的天然有机物。它在地球表面分布很广，存在于土壤、煤炭、湖泊、河流及海洋中，总量达万亿吨。天然腐植酸可分为土壤腐植酸，水体腐植酸和煤炭腐植酸三大类。土壤和水体腐植酸虽然总量很大，但百分含量很低，因此作为资源开发几乎是不可能的。工业上腐植酸的主要原料是一些低热值的煤炭，主要包括泥炭、褐煤和风化煤。我国的煤炭储量非常丰富，根据资料，煤的总储量有数千亿吨。其中有泥炭和褐煤共约1300亿吨，风化煤的数量虽没有统计数据，但也不在少数1。腐植酸是植物的残骸在微生物参与下经过复杂的化学、生物的分解及合成反应生成的产物。根据对腐植酸的化学元素分析，腐植酸的主要元素组成为碳、氢、氧、氮和硫。对于不同来源的腐植酸，如土壤腐植酸与煤炭腐植酸； 不同地点的泥碳、褐煤、风化煤中的腐植酸，其主要元素的含量是不同的，但变化范围不是很大，且无论何种来源的腐植酸都是以碳和氧为主要元素，而氮、氢和硫是少量的。从多年来腐植酸工作者的研究报告中可以清楚地看到这一点2。但不同来源的腐植酸在组成，性质上均有一定的差异。因为从植物及各种煤的组成成分看，其主要组成元素含量有较大的差异，随着煤化程度的增加，煤中碳含量增加，氢、氧含量减小3。按照腐植酸在不同溶剂中的溶解度、颜色和分子量的不同而分为黄腐酸(Fulvic Acid，简写FA)，棕腐酸(Brown Humic Acid)和黑腐酸(Black Humic Acid)。黄腐酸分子量最小，溶于酸、碱和水；棕腐酸不溶于水，不溶于酸，可溶于碱和乙醇，呈棕色；黑腐酸既不溶于酸，又不溶于乙醇或丙酮，仅溶于碱溶液，呈黑色4。棕腐酸和黑腐酸又合称胡敏酸5。12生化黄鹿酸的界定和性质黄腐酸是腐植酸中的一个组分，可以从煤炭来源的腐植酸中分离获得或直接从泥炭、风化煤中提取(即矿源腐植酸MFA)，也可以利用生物技术的方法以农林下脚料为原料人工制造，即为生化黄腐酸(Biotechnology Fulvic Acid，简称BFA)。BFA是近年来开发成功的一些新产品，是一类成分复杂的天然有机物，它是将农村下脚料秸秆及木屑等物质在微生物发酵作用下经过复杂的生物、化学的分解及合成反应生成的产物。由于BFA来源的特殊性，使得BFA在其元素组成上与其他来源的腐植酸或黄腐酸物质既有共同性，又有着其自身的特点。关于BFA的元素组成，中国科学院化学所曾对河北深州特种化工厂生产的5批BFA产品的碳、氢、氮元素含量进行了测定。其测定结果的平均值为干基灰分含量179，碳含量3905，氢含量599，氮含量444。由此可知BFA中碳含量低于一般矿源黄腐酸，而氢含量和氮含量均高于一般黄腐酸，总的看来，BFA在元素组成上与泥炭黄腐酸更为接近，而在各种腐植酸原料中，泥炭是植物煤化的初级阶段。这进一步证明了BFA的生成是模拟了泥炭腐植酸生成的前期过程6。研究表明7：生化黄腐酸与普通矿源腐植酸相比，分子量小，生物活性高，水溶性好，抗硬水能力强，并且具有更高比例的官能团，使其络合、螯合能力更强；生化黄腐酸的絮凝极限明显高于煤炭来源的腐植酸，黄腐酸具有相当强的抗絮凝作用的能力。13生化黄腐酸的应用生化黄腐酸是多种有益物质组成的复合体，加之其独有的五大特点，它对生物具有极大的活性，能明显提高动植物的免疫功能和抗逆性能，改善土地盐碱化程度，与化肥农药复合施用能显著提高肥力，降低化肥的使用量而减少危害。因此生化黄腐酸是生产无毒无公害化肥、农药和饲料掭加剂的新型替换原料，可以广泛应用于农业、医药、工业等领域。其在农业生产中的应用主要表现在：1BFA经微生物发酵而成，是一种成分极为复杂的混合物，含有大量对植物生长过程有影响的酶类、氨基酸、维生素和微量元素等生物活性物质和营养成分8，对促进植物生长、发育有显著功效。这一点与矿源腐植酸有根本区别。2BFA碳含量较低，分子量较小，含有丰富的羟基、酚羟基、醌基、羧基、甲氧基等活性基团，因而具有良好的水溶性，在土壤中能络合、螯合、吸附作用增强土壤的缓冲能力，提高土壤的保肥、保水能力，提高土壤的透气性和土壤微生物的活性，增加有效菌群数量来达到改良土壤的效果。3BFA是目前发现的最有效的调节叶面气孔开张度的物质。它可以缩小气孔开张度，减少水分蒸腾9，使植株和土壤保持较多的水分，同时促进种子萌发和幼苗生长10，促进生根，提高根冠值11，促进果实发育，提高果实品质12。二者相辅相成，开源节流，达到提高作物抗旱I州、节水能力的目的。4BFA能显著提高植物体内的多种酶活性和叶绿素含量，使作物新陈代谢旺盛，光合作用加强，糖分和干物质增多，从而提高作物抗寒、抗病等抗逆能力13，提高作物的产量和品质，因而是一种良好的植物生长调节荆。5BFA具有良好的离子结合能力，可显著提高植物对微量元素的吸收与运转能力。与化肥复配，可明显增加肥效，降低化肥用量，减少化肥流失。可通过物理化学作用与农药形成复合体，既可降低农药毒性，提高药效，又可减少环境的污染。6BFA技术将植物残骸转化为黄腐酸类物质作为天然绿色肥料还田，更科学的实现了“土地自养”，使土地资源获得有效的保护和再生。7由于BFA技术是成功的模拟了自然过程的生物技术，再生产过程中不需要能源，不使用和消耗化学药品，不产生废水、废渣，在生产和使用过程中对环境不产生任何污染，大量的功能集团对多种化学成分的吸附，结合和运转功能，不但可以清除环境中许多有害物质，并能在农业生产中表现出多功能、高效率和适用性广等优点，是一种极有前途的可持续发展生态农业的新型生物技术。 总之，生化黄腐酸对植物的促进作用已经从大量实验中得到证实14-17。但是，由于植物种类不同，年龄不同，培养条件不同，报道的数值也有变化18-21。2 生化黄腐酸的提取工艺2.1 BFA技术1987年李全民22所得的关于“发酵肥”的中国专利，是从发酵料中用较温和的方法提取、分离得到的黄腐酸是发酵法制备黄腐酸(BFA)技术的基础，随后1992年底通过河北省科委省级鉴定，“生化法制取黄腐酸”正式投入生产，这种技术是我国首创。BFA技术采用生物发酵手段将秸杆、木屑23等纯天然物质资源转化黄腐酸等水可溶性物质，人为地模拟了自然界中植物残骸转化为腐植酸类物质的过程。目前，在国内发酵生产BFA工艺一般是，采用纯天然物质为原料，在一定温度和pH下，加入特定菌群或以天然菌种群进行混菌发酵24、或自然发酵25，一般采用固体二步发酵，后经过液固分离，固体作为高效有机肥，液体浓缩，即成黄腐酸产品。发酵的BFA理化特性和生物活性26可以肯定：(1)BFA的主要成份的确是黄腐酸；(2)它和矿源黄腐酸(MFA)一样，属于腐植酸形成初期的产物；(3)与棕、黑腐酸相比，其缩合程度和碳含量较低，分子量较小，而含有的活性基团较多，表现出色泽较浅，水溶性较好，易于被动植物组织吸收等特点，并具有更高的生物活性；(4)一般情况下，BFA较MFA分子量更小些，絮凝极限更高，缓冲容量更大，pH值更接近中性，并在某些方面表现出更高的生物活性，使用浓度也往往更低；(5)作为发酵液粗制品，BFA是一个成分极其复杂的混合物，含有大量对生物的生理过程有影响的酶、氨基酸、维生素和微量元素，它所表现出的生物活性很可能是多种成分共同作用的结果；(6)但无论如何，它仍是一种黄腐酸，与其它来源的黄腐酸和腐植酸有许多共同的理化特性和生物活性。BFA的这种理化特性，这不仅使它在问世短短几年中便在农、林、牧及养殖业等领域得到了较广泛的应用和较大的发展，而且使我们相信它在医药、保健、发酵、建材、饲料等各个工业领域同样会有很大的发展潜力和广阔的应用前景。2.2 BFA技术中几点思考但是，目前BFA技术尚处于十分粗放的初级阶段，在菌种的分离、分析和保存；发酵原材料及发酵工艺过程规范化；生产过程的检测和控制；BFA产品的纯化等方面都存在着不容忽视的问题。BFA技术是以“天然菌群”或以“特定菌群”进行混菌发酵。但据了解目前各生产厂家并未认真地对BFA的生产菌群进行科学分离、鉴定及正确保藏，更谈不上优化菌种。菌种的变异及退化发生，使菌种的质量下降。对BFA生产原材料役有进行全面的质量检查，也没有明确的质量标准，更没有对各原料的配比及预处理、接菌量及接菌温度、发酵时间、发酵温度控制及BFA提取条件和生产过程中必要的检测等与产品质量密切相关的主要生产技术内容作出明确的说明或要求。目前所用检测BFA方法是非特异性的，无法明确地分辨所测得的含碳化合物中究竟有多少是黄腐酸而多少是葡萄糖、纤维素、淀粉、蛋白质、核酸等原材料的组成成分所发生的极为复杂的分解和重组反应，含碳化合物的分子结构和分子量等表征均会表现出的相应变化。BFA产品是一种混合物，BFA产品的“纯化”并不意味着化学上的“纯化”而主要是指根据其用途除去可能引起不良影响的那些“杂质”。它与其它化工产品有着很大的差异，可根据需要对其进行不同程度的纯化，生产出不同“级别”的产品，因此它的纯化具有较大的特殊性。2.3 发酵黄腐酸的制备提取 272.3.1发酵制备腐植酸 添加剂( 均为质量分数) : NaHCO3 9. 9% , NaCl 74. 42%, ZnO、Fe2O3、MnO2、MgO、CoCl2 适量, HCl 2148% , 鸡肠壁黏液11. 95% .锯末、玉米面、棉籽油按不同比例混合加入不同量的添加剂混合均匀后, 再加入适量的温水, 装入塑料袋密封, 放入恒温箱中发酵.2. 3. 2 黄腐酸提取工艺流程2.3. 3氧化降解制取黄腐酸 碱浸提后的清液中仍有一些腐植酸的钠盐, 其中主要是黑腐酸和棕腐酸的钠盐, 用KMnO4 氧化降解法可使它们转化为黄腐酸的钠盐. 50. 00 mL 清液用0. 25 mol/ L KMnO4 溶液在指定条件下进行反应, 过滤除去还原物MnO2, 滤液用HCl 酸化, 再离心, 除去清液, 将沉淀烘干, 得到黄腐酸粗品.2. 3. 4 黄腐酸的测定方法 黄腐酸测定采用树脂容量法28 , 溶液中的Na+ 等阳离子和树脂上的H+ 发生交换, 结果使溶液中的黄腐酸由钠盐转为酸的形式, 离心、烘干, 称其重量.总结：本文对生化黄腐酸的用途及其提取方法进行了归纳，并对目前提取中存在的问题提出了看法。在未来的一段时间内主要应探寻出适合于生化黄腐酸的分离提纯方案，以便其产率的提高。参考文献：1何立千生物技术黄腐酸的研究和应用M化学工业出版社，19992郑平煤炭腐植酸的生产和应用M北京：化学工业出版社，1991：52573中国腐植酸协会编腐植酸产品生产、应用及企业管理M1988：5-104李善祥腐植酸类物质与农药一研究应用与展望J腐植酸，2002，2：17255秦万德编腐植酸的综合利用M北京：科学出版社，1987：1-86 Kemdorff H，Schnitzer MSorption of metals on humic acidGeodimicaet,CosmochimicaActa1980，44：170117087沈玉龙，李炳焕生物技术黄腐酸微肥的生产与应用J化工进展，2001，21(1)：63648陈宝江，谷子林生化黄腐酸在饲料中的应用J饲料博览，2001，(10)：16179杨光立，黄风球，黄承武黄腐酸旱地龙在水稻上的抗旱节水机理及应用效果研究J腐植酸，1996(3)：273210黄云祥，朱通顺用BcFA浸种对油菜种子萌发、幼苗生长及产量的影响J 腐植酸1995(3)：262911中国科学技术协会第二届青年学术年会园艺学论文集E1北京：北京农业大学出版社，1995：18418812杨晓玲，齐永顺，李晓玲，等生化黄腐酸(BFA)及BcFA-K、Ca复合物在桃树上的应用研究J腐植酸，1995(3)：343613杨晓玲，齐永顺，高文清，等干旱胁迫下生化黄腐酸(BFA)对苹果树的某些生理效应J华北农学报，1995(3)：12814程渡，彭玉梅，崔鲜一，等黄腐酸旱地龙对农作物、牧草应用效果试验J 腐植酸，1996(3)：333415David PP,Nelson PV,Sanders DCA Hurnic Acid Improves Growth of Tomato Seedingin SolutionCulturePlantNutr,1994，17(1)：17317416Malik KA，Azam Y Effect of Humic Acid on Wheat(Triticum Aestuvum 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