抗体制药-课件第三章.ppt

第三章抗体制药 第一节概述一 抗体的概念最早应用的预防和治疗传染病的抗体药物为抗毒素血清 1890 Behring 1937年Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白 球蛋白 球蛋白 球蛋白 丙种球蛋白 并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分 因此 在相当一段时间内 丙种球蛋白成为抗体的同义词 1 抗体 Antibody Ab 指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白 抗体产生的原因 机体免疫系统因病原菌 病毒感染 受抗原物质刺激后产生B淋巴细胞 被活化的B淋巴细胞经增殖 分化产生浆细胞 浆细胞合成和分泌抗体 2 免疫球蛋白 Immunoglobulin Ig 具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白 所有的抗体均是Ig 但并非所有的Ig都是抗体 Ig是化学结构的概念 抗体是生物学功能的概念 3 多克隆抗体 针对多种抗原决定簇的抗体 由于病原菌含有多种抗原决定簇的抗原物质 由此刺激而产生的抗体制剂是多种抗体的混合物 其产量低 难以满足临床需要 4 单克隆抗体 MonoclonalAntibody McAb 采用B淋巴细胞杂交瘤技术 由纯一的单克隆细胞系产生的 针对一个抗原决定簇的 结构和特异性完全相同的高纯度抗体称单克隆抗体 特点 a 具有高度的特异性 均一性 b 来源稳定 可大量生产 为抗体制备和应用提供了全新的手段 二 临床实践中的作用 1 用于疾病的诊断a 利用单克隆抗体检测与某些疾病相关的抗原 辅助临床诊断 b 用放射性标记的单克隆抗体进行肿瘤显像 做免疫定位诊断 2 McAb制剂用于疾病的治疗a 针对分化抗原CD3的单克隆抗体对器官移植排斥反应有显著的抑制效果 b 以McAb作为载体的导向药物可对肿瘤进行定向治疗 近年来通过对McAb的改造 消除其鼠源性 免疫原性 并降低其分子量 只保留其同抗原特异性结合的活性 再用其制备导向药物用于肿瘤治疗 进而提高了免疫导向疗法的效果 使该领域得以迅速发展 目前成为抗体应用研究的热点 第二节单克隆抗体的制备 单克隆抗体是将能产生抗体的B淋巴细胞与具有无限增殖能力的骨髓细胞进行原生质体融合 通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的 一 McAb制备的一般程序B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 融合杂交瘤细胞 有限稀释 克隆化纯一的单克隆细胞系 McAb 抗原矿物油 注射活鼠注射BalB c小鼠刺激产生免疫反应诱发产生骨髓瘤细胞 制备取鼠脾脏 B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 HGPR缺陷 融合 PEG 制取B淋巴细胞分装多孔板选择性培 HAT 亲株死亡B淋巴细胞培养杂交瘤细胞生长繁殖 有限稀释 克隆化制取多克隆抗体分离出单克隆细胞系 McAb 二 McAb制备的基本技术 一 抗原的制备制备针对特定抗原的单克隆抗体 首先要制备用于免疫的适当抗原 1 化学合成法制备高纯度的单一抗原在已知抗原的化学组成和结构的情况下进行 2 由病原菌 病毒或肿瘤细胞制备只能得到部分纯化 甚至是极不纯的抗原混合物 3 用整个细胞或病毒为免疫原刺激动物细胞产生免疫反应动物产生免疫反应后取其B淋巴细胞 B淋巴细胞融合杂交后 再经筛选 克隆化 鉴别筛选出纯一的单克隆杂交瘤细胞系 二 免疫动物品系的选择 多采用与骨髓瘤细胞供体相同品系的动物做为免疫动物 因种系距离越远 产生的杂交瘤越不稳定 常采用BalB C小鼠和Lou大鼠 应考虑所选动物对所用抗原能否产生良好的免疫应答 若不能 应改用其他品系的小鼠或大鼠 三 动物免疫1 体内免疫法适用于抗原量多 免疫原性强的情况 常用8 12周龄的雌性鼠 1 颗粒性抗原 细胞抗原 免疫原性强 可不加佐剂 直接注入腹腔刺激动物免疫 初次免疫 腹腔注射107个细胞 3周后 追加免疫1 2次 腹腔注射1 5 106个在缓冲盐溶液中洗过的细胞 融合前4 5天 静脉注射1 5 106个细胞 2 可溶性抗原 按每只小鼠10 100 g抗原与福氏完全佐剂等量混合皮下注射 3 4周后 100 g抗原在福氏完全佐剂中追加一次 采集脾细胞前3天由静脉注射最后一次100 g抗原 因免疫后第3天B淋巴细胞的增殖率最高 是处于迅速分裂期的细胞 有利于融合后增殖 福氏完全佐剂是由矿物油 乳化剂和杀死的分枝杆菌组成的油包水型的乳化佐剂 对于刺激细胞免疫和某些实验性免疫尤其有效 为促进B淋巴细胞转化 提高脾细胞分泌抗体的能力 可在注射抗原的同时加入细菌脂多糖 2 体外免疫 1 特点a 所用抗原量少 只需几 g 免疫期短 仅4 5天 干扰因素少 b 融合后产生的杂交瘤细胞不够稳定 适用于不能采用体内免疫法的情况 如制备人源性McAb 或者抗原的免疫原性极弱且能引起免疫抑制时使用 2 基本方法 采用4 8周龄BaLB C小鼠的脾脏制成单细胞悬液 加入抗原使其浓度达到0 5 5 g ml 在5 CO2 37 下培养4 5天 分离脾细胞 进行细胞融合 3 其它免疫方法近年来 其它免疫方法研究的较多 有脾内免疫 腹贮植入 淋巴结注射 足垫注射等方法 其目的主要是减少抗原用量和注射次数 缩短免疫周期 四 骨髓瘤细胞的来源和特性1 来源 1 骨髓瘤细胞的来源应同免疫动物的种属一致 一般不选择产生自身免疫球蛋白的细胞系 2 鼠类骨髓瘤细胞系主要来自于BalB C小鼠 少数来自于Lou大鼠 这些细胞系能够在D 15或其他培养基中保存 在用于融合前应保持其活力较高 目前这类细胞系有商品供应 常用的鼠类骨髓瘤细胞系有NS 1 X45 X63 P3 653和SP2 O等 其最适培养的细胞密度为2 5 105细胞 ml 细胞密度过高易引起细胞死亡 可用培养基内酚红指示剂监测 开始生长时呈橙色 由于细胞生长 PH降低 当变为纯黄色时需补加新鲜培养基降低细胞密度 正常培养基颜色维持在黄橙色之间 2 制取骨髓瘤细胞的制取 用矿物油注射入小鼠腹腔内 诱发产生腹水癌型浆细胞 再由腹腔抽取腹水癌细胞 从中分离获得 3 骨髓瘤细胞系的特性 不能产生自身免疫球蛋白为避免杂交瘤细胞分泌的抗体不纯 骨髓瘤细胞不具有产生抗体的能力 应为HGPRT缺陷的细胞系其细胞内嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸合成的补救途径必须丧失 即磷酸核糖转移酶或嘧啶核苷酸激酶的活力丧失 即HGPRT阴性细胞 融合率高 容易培养 所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定 如 SP2 O和P3 653细胞系 五 细胞融合1 基本方法 取适量B淋巴细胞 1 108 ml 与骨髓瘤细胞 2 3 107 ml 进行混合 在聚乙二醇 PEG 作用下诱导它们融合 时间在2min内 然后用HAT培养液将PEG融合液缓慢稀释 2 促进融合的条件 分子量在400 6000 浓度在10 60 之间的PEG溶液都能使细胞发生融合 目前常用分子量4000 浓度为40 50 的PEG溶液为最佳 在PEG溶液中加入二甲基亚砜 DMSO 以提高细胞接触的紧密性 提高融合率 但PEG和DMSO都对细胞有毒性 必须严格控制它们与细胞接触的时间 应尽快用新配制的培养液来稀释助融剂并洗涤细胞 通过低速离心使细胞接触更为紧密来提高融合率 六 选择性培养细胞融合后 可产生多种融合细胞 B B B 瘤 瘤 瘤的融合细胞 还有许多未融合的亲株细胞 它们均比B 瘤融合的杂交瘤细胞有更强的增殖能力 很易将其淘汰 因此 融合后必须立即移入选择性培养基中培养 1 选择性培养的原理选择性培养基为HAT培养基 它是用次黄嘌呤 H 氨基喋呤 A 和胸腺嘧啶 T 配制的 其中氨基喋呤 A 能阻断DNA合成的主要途径 骨髓瘤细胞因是HGPRT缺失型 无DNA合成的补偿途径 因此瘤细胞和瘤 瘤融合细胞因不能合成DNA而死亡 而B细胞和B B融合细胞在这样的离体组织培养条件下 无法生存几天内亦迅速死亡 骨髓瘤细胞是HGPRT 磷酸核糖转移酶 缺陷型 但B细胞中有这种酶 因此B 瘤融合的杂交瘤细胞含有HGPRT酶 可利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶 T 来合成DNA 使杂交瘤细胞得以生长 2 选择性培养的基本方法 将融合反应后的细胞悬浮液于HAT培养液 加入到含有饲养细胞的96孔板内 0 1ml 孔 7天内用HAT培养液培养 每2 3天换液一次 换液时吸去1 2 2 3培养液 加入等量的新鲜培养液 第7 14天改用HT培养液 14天以后用普通的RPMI1640完全培养液 融合后培养的第9 11天 就可对所有克隆生长孔的培养上清液进行抗体检测 筛出产生抗体的阳性克隆 3 饲养细胞 促进融合细胞的生长 单个或少数杂交瘤细胞多半不易存活 通常要加入饲养细胞才能使其繁殖 常用饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞 脾细胞 未经免疫的脾细胞 和胸腺细胞等 饲养细胞能释放某些生长刺激因子 并能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性 小鼠腹腔巨噬细胞还具有清除死亡细胞和减少支原体污染的作用 七 杂交瘤培养物 阳性克隆 的鉴定与检测经培养而得到的杂交瘤细胞 只有一部分细胞可能产生针对特异抗原的目的抗体 因抗体产生细胞只占所有脾细胞的5 左右 因此 在培养9 11天左右 杂交瘤细胞集落直径达1mm时 就应对其能否分泌抗体进行特异性鉴定 以便对抗体分泌阳性的杂交瘤细胞进行克隆化和扩张 检测时 取上清液的一半体积用于抗体测定 其余再补加等量的HT完全培养基 1 鉴定与检测方法的要求应快速 灵敏 特异性 专一性 强 微量 简便并一次能检测大批标本 2 常用的检测方法有 抗原直接结合法 适用于检测能与可溶性和颗粒抗原特异结合的抗体 利用第二抗体检测的方法 适用于检测能与可溶性和颗粒抗原特异结合的抗体 有酶联免疫法 放射免疫法 免疫电镜技术 免疫荧光技术 1 抗原直接结合法 选取相应的纯一抗原 用125I进行标记 然后和杂交瘤细胞培养的上清液混合 在一定温度下反应一定时间 如4 1h等 再通过活性炭吸附 PEG6000沉淀或凝胶层析的方法分离未结合的抗原 纯化抗体抗原免疫复合物 最后通过测定其复合物的放射性强弱来进行定性和定量测定 2 利用第二抗体检测第二抗体 能与抗原和抗体发生免疫反应后形成的复合物进行特异结合的抗体 又称抗抗体 应用第二抗体检测杂交瘤分泌的抗体时 需采用免疫标记技术 将第二抗体用125I放射性同位素标记 或与酶连接 或与荧光染料连接 或用电子致密物质加以标记 以提高检测的准确性和灵敏度 具有应用范围广 反应速度快 容易观察 且能进行定量和定性检测的特点 免疫荧光技术是利用结合有荧光素的第二抗体与抗原抗体的免疫复合物特异性结合 再检测荧光强度实现定性定量检测的技术 常用的荧光素有异氰基荧光素 FIC 异硫氰基荧光素等 基本原理 荧光素可与第二抗体球蛋白中赖氨酸的氨基结合 在蓝紫光激发下发射出鲜明的黄绿色或玫瑰红色 而且结合荧光素的第二抗体与抗原抗体复合物结合后仍能发出荧光 酶联免疫技术用酶标记抗体或第二抗体来进行抗原抗体反应或第二免疫反应 检测酶标记的抗体或第二抗体是通过酶与特殊底物的反应来进行的 颜色变化 氧化还原电位变化等 通常用的酶有 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 半乳糖苷酶和葡萄糖苷酶等 应用发展最快的是酶联免疫吸附法 是检测杂交瘤细胞培养上清液中抗体的一种最有效方法 放射免疫技术是应用同位素标记的第二抗体与抗原抗体复合物进行特异结合 再通过检测放射强度来进行定性定量检测抗体的方法 具有高灵敏度和血清反应的高特异性的优点 但需要 计数器等检测放射性的特殊仪器 免疫电镜技术 是利用电子致密物质标记第二抗体后再与抗原抗体复合物结合 最后用电子显微镜检测的技术 3 免疫标记技术的方法步骤 将特定的纯一抗原 20 g ml 吸附在微量滴定板小孔中 每孔50 100 l抗原溶液 37 温育2h或4 过夜 倾去抗原溶液 用DPBS缓冲液洗涤小孔3次 这时小孔上已粘附了特定的抗原 用一种不能与待检测抗体结合的蛋白质饱和小孔内剩余的蛋白质结合位点 1 的牛血清蛋白DPBS缓冲液250 l 然后同样用DPBS缓冲液洗涤小孔3次 加入待检测的杂交瘤培养上清液 每小孔加入上清液50 100 l 在37 下温育2h 使待测抗体与抗原充分结合 倾去上清液 用DPBS缓冲液洗涤3次 加入用免疫标记技术标记的第二抗体 使其与已形成的抗原抗体复合物结合 然后用相应的方法检测 如 采用酶联免疫技术每小孔加入50 100 l酶与第二抗体连接物的溶液 37 下反应30min 使第二抗体与抗原抗体复合物结合 然后 再用含0 05 Tween 20的DPBS液洗涤小孔5次 再加入50 100 l酶的底物溶液 使底物与 抗原 抗体 第二抗体 酶的复合物在一定条件下反应 最后用多用扫描仪在特定波长下测定反应产物的光密度 再换算成待测抗体的浓度 八 杂交瘤细胞的克隆化 筛选出的阳性克隆中 细胞集落 可能含有不分泌抗体的细胞 或有多株分泌不同抗体的细胞 而且刚融合获得的杂交瘤细胞不稳定 染色体易丢失 因此 必须尽早进行克隆化 克隆化 分离获得单细胞并将单细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个过程 这些细胞集团中的每个细胞的生物学特性和功能是完全相同 一般融合鉴定后获得的杂交瘤细胞集落要经约3次克隆化 才能达到100 孔内均为单克隆抗体阳性细胞 常用的克隆化方法有有限稀释法和软琼脂法 1 有限稀释法将杂交瘤细胞集落制成单细胞悬浮液 经稀释到一定细胞浓度后 加入到96孔细胞培养板中 使每个孔中在理论上只含有一个细胞 经培养 检测和鉴定后进一步分离筛选 第一次克隆化时要应用HT培养液 以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培养液 由于单个细胞难以存活 克隆化培养时需加入饲养细胞辅助其生长 抗体的检测 鉴别 2 软琼脂法是在培养液中加入0 5 左右的琼脂糖凝胶 将杂交瘤集落的单细胞悬浮液加入其中 细胞分裂后形成小球样团块 由于培养基是半固体状态 可用毛细吸管将小球吸出 团块经打碎后再制成单细胞悬浮液 移入96孔板中继续培养和鉴定 用这种方法可以吸出大量克隆细胞进行培养 因初代细胞很不易增殖 所以用软琼脂法进行克隆化容易成功 九 杂交瘤细胞与McAb的鉴定 1 杂交瘤细胞的鉴定对杂交瘤细胞进行染色体分析 不仅可作为鉴定的指标 还能帮助了解其分泌抗体的能力 1 杂交亲本的染色体特点鼠的脾细胞染色体数为40 全部是端着丝点染色体 小鼠骨髓瘤细胞的染色体数变异较大 SP2 O细胞系为62 68 NS 1细胞系为54 64 大多数为非整倍体性 并且有中部和亚中部着丝点染色体 2 杂交瘤细胞的染色体特点 杂交瘤细胞染色体数目接近两种亲本细胞染色体数目的总和 在结构上除多数为端着丝点染色体外 还有少数的中着丝点或亚中着丝点标志染色体 染色体数目较多且又比较集中的杂交瘤细胞能稳定分泌高效价的抗体 而染色体数目少且较分散的杂交瘤细胞分泌抗体的能力较低 2 McAb的鉴定 1 免疫球蛋白类和亚类的鉴定由于不同类和亚类的免疫球蛋白生物学特性差异较大 因此要对制备的杂交瘤细胞所产生的McAb进行Ig类和亚类的鉴定 方法 可用羊或免抗Ig不同类和亚类的抗体 进行免疫扩散或酶联免疫吸附试验 ELISA 进行鉴定 2 McAb与对应抗原的亲和力测定可为正确选择不同用途的McAb提供依据 3 对McAb进行特异性 纯度和识别抗原的相对分子质量等进行测定 十 单克隆抗体的大量制备 McAb的大量制备有体外培养法和体内诱生法 1 体内诱生法可获得5 20mg ml的抗体 目前多采用 1 动物选择 选用BALB C小鼠来制备 2 基本方法 在接种杂交瘤细胞前1 2周 先给小鼠腹腔注射0 5ml降植烷