降解亚硝酸根菌种的筛选.doc

降解亚硝酸根菌种的筛选摘要硝化细菌是一种好气性细菌，能在有氧的水中或砂层中生长，并在氮循环水质净化过程中扮演很重要的角色。它们包括形态互异类型的一种杆菌、球菌或螺旋菌。属于自营性细菌的一类。包括两种完全不同代谢群：亚硝酸菌属和硝酸菌属.任何水产养殖池都会产生有机废物，它们绝大部分属于养殖生物的排泄物，还有大量的饵料残余物，如果不及时将中些物质净化或排除，将会给水中的异营性细菌提供大量繁殖的机会，并排除有毒的氨。如果水质偏向碱性，一部分的铵就会自然地转化成氨，当水中的氨浓度达到养殖生物的致死浓度时，就会给广大的养殖用户造成重大的损失。硝化细菌是一类具有硝化作用的化能自养菌，包括硝化菌和亚硝化菌两个生理菌群，其主要特性是自养性，生长速率低，好氧性，依附性和产酸性等。可通过NH4+ NO2- NO3-这一过程将NH4+转化为NO3-。能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养殖业及环境保护具有重要意义,对提高水产品产量,促进水产品养殖业的发展具有不可估量的作用。关键词:硝化细菌、亚硝化菌、转化、(关键词5个7个)AbstractNitrifying bacteria is an aerobic bacteria, to the water or in the presence of oxygen in the growth of sand and water purification in the nitrogen cycle plays a very important role. They include different types of form among a bacillus, or spirillum bacteria . Are self-employed for a class of bacteria. Including two completely different metabolic groups: nitrite and nitrate species genus. Any aquaculture will have a pool of organic waste, which the vast majority of the waste bio-farming, there are a large number of food residues, in a timely manner if we do not purify or exclude some material will be different to the water business to provide a large number of bacteria the opportunity to breed and to remove toxic ammonia. If preferred alkaline water, the ammonium will be part of a natural transformation into ammonia, the ammonia concentration when the water reached a lethal concentration of biological culture, the culture will be to the vast number of users causing significant losses. nitrifying bacteria are a class of nitrification bacteria to self-support, including nitrification bacteria and fungi Nitrosation two physiological microflora, its main characteristic is self-support and low growth rate, aerobic, and the middle class dependent on acidity. By NH4+ NO2- NO3-to NH4+in the process transformed intoNO3-. Can effectively reduce ammonia and nitrite nitrogen in water content, the aquaculture industry and the importance of environmental protection.Key Word：1.文献综述1.1亚硝酸盐目前，随着高密度集约化养殖水平的提高，亚硝酸盐引起的水质恶化越来越受到养殖界和相关学者的重视，其对水生动物的毒害作用也严重制约着水产养殖业的发展。亚硝酸盐是生态系统中氮循环的一个天然组成部分，亚硝酸盐是水产养殖系统中一种潜在的污染物，淡水鱼类通过鳃主动吸收亚硝酸盐，导致体内亚硝酸盐的浓度过高【1】。近年来，高密度高投饵的集约化养殖方式造成的高蛋白残饵和高含氮排泄物超越养殖水体自然菌群的代谢能力而不断沉积于池底2，是养殖水体中亚硝酸盐等有害物质不断增加的最主要原因【3】。亚硝酸盐浓度的升高已成为影响水产养殖业发展的主要问题【4】，也是诱发鱼病的主要环境因子【5】，甚至可能造成大量的水生动物死亡【6】，给水产养殖业带来巨大的经济损失！亚硝酸盐是细菌硝化作用和生态系统中脱氮作用过程的中间产物（图1），也是水产养殖系统中最常见的污染物【7】。亚硝酸盐是由氨转变而来的，这是由亚硝化细菌完成的8。亚硝酸盐是由氨转变而来的，这是由亚硝化细菌完成的，而亚硝化细菌的生长繁殖速度为18 min一个世代9，因此，其转化的时间较短；另一类细菌，称为硝化杆菌，它可以把亚硝酸盐转变为硝酸盐10。硝化细菌的生长速度相对较慢，其繁殖速度为18 h一个世代，因此，由亚硝酸盐转化到硝酸盐的时间就长很多11。而脱氮作用是通过许多兼性厌氧菌来实现的，它还原硝酸盐为N2与N2O、NO-和N02-等这样的中问产物12。天然水环境中亚硝酸盐的浓度是非常低的，在微摩范围内，而在商业化鱼类和观赏鱼类的集约化养殖过程中，由于硝化细菌(Nitrosomas sp和Mtrobacter sp)活性失调 和脱氮作用过程的不平衡。都可能引起亚硝酸盐的过量产生13，水中亚硝酸盐的浓度甚至可达1 mM (50 mgL )或更高14。近年来，随着水资源污染越来越严重，养殖水体中的亚硝酸盐、氨氮含量越来越高，这已经逐渐成为困扰水体养殖者的一个心病，如何解决水体中这些物质的含量呢？通过了解我们知道，并不是有亚硝酸根存在就会使鱼类、水草中毒，而是水体中的亚硝酸根含量超标，才会引起亚硝酸根在鱼体内累积，当人们误食入亚硝酸根中毒的鱼，从而导致人类亚硝酸根中毒15。而亚硝酸根是如何产生的呢？这是由于水体中的氨不能够及时被转化，从而转换成了亚硝酸盐，并在水体中累积，通过食物链进入我们人体。由于在水产的高密度养殖过程中必须连续地充氧以保证水中一定量的溶解氧，厌氧反硝化细菌的反硝化作用就不能充分地发挥好氧反硝化细菌作为一种新型的脱氮细菌而备受关注细菌好氧反硝化与传统的细菌厌氧反硝化相比具有独特优势：第一，细菌在有氧条件下进行反硝化，使硝化和反硝化作用能够同时进行，硝化反应的产物可直接作为反硝化作用的底物，避免了硝酸根、亚硝酸根的积累对硝化反应的抑制，加速了硝化反硝化的进程，且反硝化释放出的OH一（应该是右上角标）可部分补偿硝化反应所消耗的碱，使系统中pH值相对稳定；第二，与传统的化学自养硝化菌不同，好氧反硝化菌(多数也是异养硝化菌)可将氨在好氧条件下直接转换成气态的产物，且反应可由单一反应器一步完成，降低了操作难度和运行成本；第三，大部分好氧反硝化菌能很好地适应厌氧(或缺氧)周期变化，在有氧缺氧交替时具有生态生长优势，其生长速度快、产量高、要求的溶解氧浓度较低、能在偏酸性环境中生长，细菌培养投资少，且反应速度快，反硝化彻底，适合治理大面积氮污染水域16。传统理论认为反硝化细菌是异养厌氧的，但到目前为止除了发现好氧反硝化细菌外，还发现存在自养型反硝化菌，能利用一些无机物在氧化过程中释放出来的能量将硝酸根还原，发挥反硝化作用如备受关注的脱氮硫杆菌（Thiobacillus denitrifican）17异养反硝化的研究细致深入，各种工艺设计参数较多，但需要投加有机物，提高运行成本的同时也容易造成二次污染，使它的应用受到限制而自养反硝化存在2个优势：第一，不需要投放有机物作为碳源，节省开支；第二，产生极少量的污泥，能将污泥处理量降低到最小 自养反硝化又为生物脱氮开辟了一条新的途径。实践证明18,生物方法能够有效的解决水体中存在的这些问题。即经济又实用，而且能达到无二次污染。还能丰富水体中的微生物种群环境，还能丰富水草的肥料，进而为鱼群创造大量的食物19。1.2反硝化细菌作用机理反硝化细菌是指一类能将硝态氮(NO-3)还原为气态氮(N2)的细菌群,它们分散于10个不同的细菌科中,已知的有50属以上的微生物能够进行反硝化左右,自然界中最普遍的反硝化细菌是假单胞菌属,其次是产碱杆菌属。根据已有的讲究结果,反硝化吸进的反硝化作用分4步进行,即: NO-3一N0-2一N0一N20一N2,分别由硝酸还原酶、亚硝酸还原、NO还原酶、N20还原酶催化3.传统观点认为反硝化作用的一个重要条件是厌氧环境，在O2和NO3-,-同时存在时，反硝化菌首先利用O2作为最终电子受体，只有溶解氧浓度接近零时才开始发挥反硝化作用。1.3研究意义 从生物工程学筛选菌种的角度对硝化细菌进行研究，寻找一种最高效的硝化细菌，对促进生物脱氮理论的研究有一定的参考意义。2.实验部分2.1 实验药品及器材2.1.1实验药品 表1药品及仪器 厂址亚硝酸钠 北京化工厂蛋白胨 北京奥博兴生物技术有限责任公司牛肉膏 北京奥博兴生物技术有限责任公司葡萄糖琼脂氯化钠氢氧化钠75%乙醇碘液结晶紫试剂翻红试剂高压灭菌锅恒温培养箱无菌操作台PH试纸北京益利精细化学品有限公司海南省琼海市长青琼脂加工厂天津市博迪化工有限公司沈阳市新华试剂厂沈阳市新华试剂厂实验室提供实验室提供实验室提供上海申安医疗器械厂金坛市富华仪器有限公司沈阳市医疗器械工厂天津塘沽澳科精细化工有限公司蛋白胨 牛肉膏 葡萄糖 琼脂 氯化钠 亚硝酸钠 氢氧化钠 75%乙醇 碘液 结晶紫试剂 番红（以上的纯度，厂家）试剂 KH2PO3 蒸馏水 2.1.2实验器材高压灭菌锅 恒温培养箱 无菌操作台 烘干箱 显微镜（厂家）试管 三角瓶 烧杯 电子天平 PH试纸（114）培养皿 吸管 酒精灯 恒温培养箱 药匙 接种环 玻璃棒载玻片 2.2实验原理试验采用富集培养的方法确定细菌的样本。富集培养主要是利用不同的微生物生命活动的特点的不同，认为的控制环境条件，仅使适合于改条件的微生物旺盛生长，使其在菌群中的数量显著增加，成为优势微生物，从而更有利于人们分离自己所需的特定微生物.富集条件可根据所需分离的微生物的特点从物理、化学、生物等多个方面进行选择，如温度、PH、氧气、营养等。硝化细菌大部分属于无机化能自养菌，生长周期长，生长极其缓慢，而伴生的异养菌却生长迅速.为使自然条件下生长劣势的硝化细菌转化为生长优势菌，确定以含亚硝酸钠的肉汤培养基进行富集培养，限制其他菌的生长、繁殖。2.3实验方法及步骤2.3.1培养基的调配称取蛋白胨1g，牛肉膏0.5g，琼脂1.5g，NaCl 0.5g，葡萄糖2g，（加没加进亚硝酸根？）水91ml，NaNO2 0.2g调节PH为7.6，放到高压灭菌锅内121。C ，灭菌20分钟。2.3.2接种将灭过菌的培养基（不倒板？）在无菌试验室的无菌操作台上接种,菌种来源是石油二厂的活性污泥、校内实验楼后的小河沟内的淤泥和姚秀清老师实验室提供的硝化细菌，分别接种后培养24小时。2.3.3 扩大培养 挑选培养基表面具有代表性的单菌落重新接种到试管斜面（这个培养基是什么配方）,放到恒温培养箱中27。C再次培养12小时。2.3.3制作观察涂片 挑选试管中（一个试管里还有几种吗？）代表性极强的菌落，用接种环（灭菌不？冷却不？）挑去一点，在载玻片上加一点蒸馏水轻轻研磨，然后放到酒精灯上慢慢烤干，等载玻片干燥后用结晶紫试剂进行除染（滴加多少染液，染多久）在次放到酒精灯上烤干，（不用水洗？）用碘液进行媒染，等待2分钟，等载玻片自然干燥后（不用水洗？），用75%的乙醇进行脱色处理，（脱色多少时间？脱到啥程度？）（不用水洗？）然后再用酒精灯将载玻片烤干，最后用番红试剂复染（染多久？）（不用水洗？）.等载玻片干燥后就可以反倒显微镜下进行观察了。2.3.4观察结果将制作好的涂片放到显微镜下观察,用5*40的进行初步观察,后换10*40的在次观察。经培养得出由石油二厂提供的污泥所接种长出的菌落，长势良好，菌落大，颜色淡黄.又姚秀清老师实验室接种的硝化细菌长势良好，菌落大小适中，颜色略白.又校内实验楼后小河沟接种的菌落长势不太好。2.3.5纯化 将培养基的浓度改为0.3g/L,灭菌过后将培养过的菌种接种到新的培养基上.等待24小时后,再次进行扩大培养。2.3.6观察结果 挑取代表性的单菌落制作涂片，将制作好的细菌观察涂片放到显微镜下观察。可以看到显微镜下,涂片上是杆状的细菌,红色,说明该菌为革兰氏阴性菌。2.3.7多次纯化 再次改变培养基内的亚硝酸钠的含量为0.1g/,进行接种、培养、染色观察、改变培养基的亚硝酸钠含量为1.5g/L接种、培养、染色观察。2.3.8菌株最适合培养基的测定将筛选好的硝化细菌，接种到加入不同量亚硝酸钠的培养基（固体的？还是液体的？）上，27。C恒温培养12小时，稀释平板法测定菌株的菌体浓度。2.3.9菌株最适合培养温度的确定分别设定28。C、30。C、33。C、37。C、40。C、45。C（温差怎么不是相等的？）等温度下，在上面选择的最适合培养基培养24小时，观察细菌的生长情况和菌落数量，得出菌体的最适合生长温度，每次处理重复3次。2.3.10菌体最适合培养时间的确定 设10小时、20小时、50小时、72小时、100小时、120小时等时间剃度，在最适合温度最适合培养基下培养，用血球计数板测定所筛选的菌株在最适生长条件下菌体的最高浓度，每次处理重复3次。结果与讨论3.1硝化细菌硝化细菌是一种好氧细菌，能在有氧气的水中或砂砾中生长，并在氮循环水质净化过程中扮演着重要的角色。它们包括形态互异类型的一种杆菌、球菌以及螺旋型细菌，属于绝对自营性微生物的一类，包括两个完全不同代谢群：1.亚硝酸菌属（nitrosomonas）：在水中生态系统中将氨消除（经氧化作用）并生成亚硝酸的细菌类；亚硝酸菌属细菌，一般被称为“氨的氧化者”，因其所维生的食物来源是氨，氨和氧化合所生成的化学能足以使其生存。2.硝酸菌属（nitrobacter）：可将亚硝酸分子氧化再转化为硝酸分子的细菌类。硝酸菌属细菌，一般被称为“亚硝酸的氧化者”，因其所维生的食物来源是亚硝酸（但也不一定是亚硝酸，其它有机物亦有可能），它和氧化合可产生硝酸，所生成的化学能足以使其生存。因这些硝化细菌能将水中的有毒的化学物质（氨和亚硝酸）加以分解去除，故有净化水质的功能。不过需要注意：硝化细菌在水质ph中性、弱碱性的环境下发挥效果最佳，在酸性水质中发挥效果最差。3.2菌种的确定 由于硝化作用必须是由硝化细菌和亚硝化细菌共同完成，而两者对营养物质的要求又非常严格.亚硝化细菌只能利用氨产生亚硝酸,是硝化细菌进行通话作用所必须的能源物质.我们知道亚硝酸对人体来说是由害的,亚硝酸同一些金属离子结合以后可以形成亚硝酸盐,而亚硝酸盐又可以和胺类物质结合,形成具有强烈致癌作用的亚硝酸胺。 3.3影响细菌硝化作用的因素 影响细菌硝化作用的因素主要为PH、温度、有机物、亚硝酸盐、光照和自由氨等。3.3.1PH影响环境的pH必定会影响到微生物的生长于代谢，因为pH值是影响生理生化反应的重要影响因子，环境的pH值的变化引起微生物细胞表面特性的变化，从而引起细胞体生理生化过程的变化，最终导致微生物代谢与生长的变化。pH是影响硝化作用的重要环境因素之一，在pH中性或微碱性条件下，硝化过程迅速，适宜的pH是7.38.5。于亚硝酸细菌会选择此范围的上限，其最佳pH是7.68.4，这时硝化速率达到最大。pH超越这一最佳范围时，硝化速率将降低，当pH7.0时，亚硝酸细菌生长缓慢.pH6.5时，亚硝酸细菌的生长将受到抑制.PH6.0时，系统中的硝化作用将会停止.细菌的最佳pH为7.37.5。3.3.2温度影响 温度对硝化细菌的生长和硝化速率有较大的影响。一般的硝化细菌是中温生长菌，其适宜的温度范围是2530 。温度低于25 ，硝化细菌的生长缓慢，低于10 以下时硝化细菌的生长和硝化作用明显减慢。温度高于30 时，硝化细菌的生长也减慢，高于35 ，则对硝化细菌的酶系具有破坏作用，硝化细菌的生命将受到潜在的威胁。所以在任何情况下都应注意保持硝化反应器温度的稳定性，以避免极端温度和瞬间变化的温度给硝化作用带来不良的影响。对于硝化细菌的一般培养温度建议在2530 为宜。3.3.3有机物硝化细菌属于典型的自养细菌，有机物对于硝化细菌是否具有毒害作用是人们普遍争论的问题.亚同认为多种有机物对硝化作用有抑制作用。来越多的研究表明，有机物对硝化细菌的影响主要是因为有机物的存在刺激异养细菌迅速生长，从而使异养细菌与硝化细菌竞争溶解氧、氨和微量营养物质，使得硝化细菌的生长受到限制，而有机物本身并不直接影响硝化细菌的生长与硝化作用。3.3.4亚硝酸钠由于培养基内加入亚硝酸钠量的不同，所以培养出的菌落也不尽相同，低浓度的2份培养基上的菌落个数较多，但是菌落较小，颜色淡黄，高浓度的2份培养基尽管菌落数少，但是菌落很大，且菌落厚实，颜色略白。见表2、表3。表2 菌落比较亚硝酸钠含量 菌落个数菌落颜色0.2mg/L0.5mg/L1.0mg/L1.5mg/L71251淡黄淡黄略白略白 表3 单因素实验数据药品第一次第二次第三次第四次牛肉膏 g蛋白胨 g琼脂 g水 ml葡萄糖 g亚硝酸钠 gNaCl gPH1.01820.34521.70759050.30.51477.61.01850.36231.85329150.50.52017.61.02130.35231.864790510.55237.61.01540.32651.85239051.50.53627.63.3.5光照由于有些亚硝化细菌对近紫外波段的光很敏感，所以在培养的时候需要用报纸将接种后的培养皿密包，以免亚硝化细菌被近紫外波段的光照射导致死亡。3.3.6溶解氧（DO）在活性污泥硝化系统中，大多数学者认为溶解氧应控制在1.52.0 mg/L，溶解氧值偏小，一方面加剧了活性污泥的内源呼吸，造成活性污泥的大量消耗，另一方面高溶解氧对反硝化反应不利，能耗也增大，降低了设备运行的经济性。溶解氧值偏小时硝化作用将趋于升高。HANAKI研究表明，低DO下，氨氧化细菌增殖速率加快，补偿了由于缺氧造成的代谢活动下降，使得整个硝化阶段中氨氮氧化未受到明显抑制。LAANBROEK研究进一步表明在缺氧状态下，亚硝酸大量积累是由于氨氧化细菌对DO的亲和力较亚硝酸细菌强。但ECKENFELDE提出DO必须在2 mg/L以上。也有人提出DO不能低于0.5 mg/L，还有人提出对氨氧化细菌和亚硝酸细菌有所差异，DO分别为1.0、2.0 mg/L。而MICHAEL与RICHARD在总结大量文献的基础上通过对各种因素及双底物限制动力学进行分析得出结论：在较高的平均细胞停留时间的（MCRT）的条件下，DO在0.51.0 mg/L就可完成硝化作用，MCRT较低时完全硝化则需要较高的DO。而STENSTROM认为能发生硝化作用的最低DO约为0.3 mg/L。王歆朋等发现低的DO（0.8 mg/L）会对硝酸菌的生长酶系产生抑制作用，而对亚硝酸细菌的生长酶系产生促进作用。总之为了确保硝化作用有效进行，最好硝化系统中DO保持1.01.5 mg/L。3.3.7自由氨氨氮的升高导致亚硝酸氮的累积，这将严重抑制亚硝酸转化为硝酸。SHAHER曾报道：氨氮在510 mg/L，没有亚硝酸积累，他发现随着氨氮浓度由7.5 mg/L10 mg/L17 mg/L25 mg/L35 mg/L45 mg/L的逐渐升高过程中，亚硝酸积累呈增大趋势。AUTHONISEN在实验中注意到高浓度的FA对硝化反应有抑制作用，并影响到硝化产物。还有一些实验表明，高浓度的氨氮所造成的亚硝酸的积累并不稳定，时间一长系统中亚硝酸浓度和亚硝化比率均会下降，硝酸浓度增大，这说明硝酸菌对氨氮产生的抑制会逐渐适应。溶解氧和氨的浓度以及pH是影响硝化反应速率的重要环境因素。有国外文献报道，高浓度的氨可以选择一个新的硝化菌群，高氨引起的菌群的变化是逐渐发生的。这说明，硝化细菌能更好的适应高氨环境。尽管最初系统中的硝化细菌在高氨的环境中也是相当活跃的，但更能适应这一环境的硝化细菌逐渐成为这个系统的主体。在正常pH范围的情况下，pH的改变不会导致菌群种类发生改变，但是当pH低于6.0或高于8.5时就会引起硝化细菌种类会发生变化。3.4菌株最适合生长培养基的测定表4亚硝酸钠浓度菌液浓度0.0mg/L0.3mg/L0.5mg/L1.0mg/L1.5mg/L02.571052.711052.101051.54105可以得出菌在培养内亚硝酸钠的浓度为0.5mg/L生长的最好，而培养基内不加亚硝酸钠则没有菌株长出，说明菌株需要亚硝酸盐诱导才能生长。3.5菌株最适生长温度的测定 图1 细菌生长曲线细菌的生长曲线表现为4个时期：迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。由图1可以看出，细菌的指数生长期，培养50小时的时候，生长浓度达到了4.0105/mL，72小时达到4.2105/mL的最高生长浓度，100小时维持同样水平，说明有一个相对较长的稳定期，100小时后随着培养时间的继续延长，细菌的细胞浓度逐渐降低，进入了衰亡期。结论采用在富集培养补加亚硝酸盐和平板分离法，较易从自然界中分离到硝化细菌。加富培养为硝化细菌的生长繁殖创造了有利的条件， 使它较其他种类微生物生长快。在分离前用无菌玻璃珠充分振荡富集液，分离效果较好。这是因为硝化细菌具有生长在固体表面的习性， 即使在液体培养基中，它们也往往附着在培养基中固体颗粒或器壁上。用无菌玻璃珠振荡富集液可使附着的硝化细菌从附着物上游离下来，提高细胞的自由分散度。硝化细菌大多数是专性化能无机营养菌， 生长缓慢， 伴生的异养细菌生长迅速，超过硝化细菌， 而且硝化细菌代时长， 3 0 培养几天才能长成菌落，菌落较小，直径约为100，比常见的细菌单菌落小得多，肉眼不易观察，这都给分离工作带来了不便。根据目前的方法要很快分离筛选带高效硝化细菌是很困难的。因此，找到一种快速分离到硝化细菌的方法和采用基因工程技术选育优良菌种是十分有必要的。筛选到的菌株的硝化特性与一般的硝化细菌不同，其氨氮的消耗大于硝酸盐氮的生成，但又只生成极少量的硝酸盐氮，可见，部分氨氮以非传统的硝化途径进行了转变。有研究表明， Nitrosomonas等一些自养菌能在某些情况下，如缺氧、限氧、积累亚硝酸盐或存在NO2，能同时进行硝化和反硝化作用，氨氮以亚硝酸盐氮为电子受体，转变为氮气或其他含氮气体。这种现象发生的可能原因是高氨氮含量可促进亚硝化细菌的生长和氨氧化代谢，引起亚硝酸盐积累，而亚硝酸盐对细菌而言是一种有害物质，硝化细菌要尽可能地除去亚硝酸盐，从而发生反硝化作用，反硝化过程既可以除去有害的亚硝酸盐，又能保留氧气供氨氮的氧化代谢。对该菌从分子水平对相关蛋白或酶及功能基团进行研究，将有助于揭开该反应机制。结论 应用微生微生态制剂是根据微生态学原理制成的含有大量有益菌的活菌制剂，有的还含有他们的代谢产物或(和)添加了有益的生长促进因子，具有维持动植物体和人类及其内外环境的微生态平衡(或调整其微生态失调)、提高他们的健康水平和保护环境的功能Kozasa(1986)首次将微生态制剂应用于水产养殖，用一株从土壤中分离的芽孢杆菌处理13本鳗鲡而降低了由爱德华氏菌引起的死亡后，微生态制剂的研究便得到迅速发展 目前，微生态制剂在水产养殖中的应用比较广泛，也取得了巨大的经济效益和社会效益，所涉及的微生物包括光合细菌、芽孢杆菌、硝化细菌以及反硝化细菌等光合细菌能把水域中的残余有机物经异养菌分解后产生的有机酸、硫化氢及氨等作为基质合成菌体而增殖，既参与水质净化，又可被其他动物所捕食，已广泛应用于养殖水体氨氮污染生物修复中 芽孢杆菌属中的非致病菌，有些可在鱼虾的肠道内和体表定植并繁殖，形成有益菌群，竞争性地抑制肠道、体表病原菌的繁殖，提高鱼虾的免疫力；有些在繁殖过程中分泌大量的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶，能迅速降解鱼虾残留饵料和排泄物中的淀粉、蛋白和脂肪等有机物，在池内其他微生物的共同作用下，大部分进一步分解为水和二氧化碳，小部分成为新细胞合成的物质，从而起到净化水质的作用硝化细菌和反硝化细菌主要参与氮的形式的转化，硝化细菌把水中有毒的氨和亚硝酸根离子转换成无毒的硝酸根离子，减少这两种致病因子对水产动物的毒害；反硝化细菌则起到把硝酸盐、亚硝酸盐转化为无毒的氮气排出水中的作用如冯春晖等 从富营养化的养殖水体中分离筛选到硝化细菌、反硝化细菌、光合细菌、硫化细菌和生物絮凝菌等具有不同生理功能的污染物治理菌株，经优化配伍成性能优良的复合功能菌，达到有效净化养殖水体的作用应用微生物物制剂对养殖水体中的氨氮、硝态氮、亚硝酸盐污染进行生物修复是一种比较有效的方法，这项技术在国内外已经得到重视，虽然有争议，但也有不少成功的范例 J因此，通过分离、筛选具有高效氨氮转化能力的菌株，能耐受有机质及其他有害物质的干扰，经过NH4+一N0-3N2，这一生物转化过程将氨氮转化为无害的氮气释放；通过生物扩增、放大、乳化等手段制备复合微生物制剂，在养殖水体进行菌剂投放，实现氮素污染的原位修复，这已成为人们研究的方向。那是人家的结论，你应该说你的实验结论。 前景展望在集约化、规模化养殖日益成为养殖业发展主要趋势的今天，养殖水体污染现象严重，尤其是水体中的亚硝酸盐已成为阻碍养殖业发展的重要因素。随着人们环保意识的日益增强，以及微生物生态学、免疫学和分子生物学技术的不断发展和深入，硝化细菌在水产养殖业的应用研究必将更加深入，尤其是包括硝化细菌在内的多种微生物的配伍组合使用。如，已有的商品名为“益水宝”的复合制剂，是由枯草芽孢杆菌、乳酸菌及反硝化细菌复合而成的 ；目前已在日本、巴西、美国、中国等数十个国家推广使用的EM(有效微生物群)复合微生态制剂，是由光合细菌类、乳酸菌类、酵母菌类、放线菌类、醋酸杆菌类等5科10属80多种有益微生物复合培养而成的，它们在生长过程中产生的有用物质及分泌物质成为各自或相互的生长基质，形成一种共生增殖关系。由于微生态制剂具有费用省、效果好、对外界干扰少、没有或很少二次污染等优点，日益成为研究的热点，并取得了一定的治理效果。但无论是单一菌种还是复合菌种，都存在环境适应性问题。冯春晖等在动态模拟实验中发现各污染物的去除效果均较稳定，但复合菌制剂对污染物的去除不如在实验室单菌对单一污染物的去除效率高 。同时，外源微生物，尤其是“工程菌”对环境的生物安全性问题也受到社会各界的广泛担忧 目前多主张直接利用地下环境中的土著微生物，它们在接触污染物过程中已经历了一段自然驯化期，因此是地下水生物修复的首选菌种。Quince在处理400 000 L乙二醇泄露引起的土壤及地下水污染时，外加了商业菌、营养物质和空气，一段时间后检测井中污染物的含量由36 000 mgL 下降到100 mgL，但发现外加菌的生长率很低所以，只有在土著微生物不能降解或污染物浓度很高，又必须快速处理时，才考虑外加菌种 目前水产行业市面上的一些商品名称不一的微生态制剂存在产品性状不稳定、产品的针对性较差、使用效果不理想等问题；另外，产品的保质期较短，以及缺乏长期的作用技术等，也制约了微生态制剂在水产养殖业的推广应用。自然界蕴藏着丰富的硝化细菌，通过合适的方法可从不同的环境包括灌渠、池塘、土壤以及活性污泥中分离获得对养殖水体而言，从养殖水体污泥中有针对性地筛选、培养和驯化高效的硝化细菌，进一步开发利用各类硝化细菌及其他具有不同净水功能的微生物，针对治理对象的不同特点，利用菌株性能上的差异，将其组合并采用多种工艺手段，以满足多种水体的治理要求，达到治理大面积养殖水域的效果。参考文献：1JENSEN F BNitrite disrupts multiple physiological functions in aquatie animalsJComp Biochem Physiol，2007，135A (1)：9242YILDIZ H Y，BENLI A C KNitrite toxicity to crayfish，Astacus leptodactylltS，the effects of sublethal nitrite exposure on hemolymphnitrite，total hemoeyte counts，and hemolymph glucoseJEcotoxicol Environ Saf，2008，59 (3)：3703753TEADU FERREIRA DA COSTA O，DOS SANTOS FERREIRA D J，LO PRESTI MENDONCA F，et a1 Susceptibility of the Amazonian fish，Colossoma macropomum (Serrasalminae)，to shortterm exposure to nitriteJAquac，2007，232(14)：6276364余瑞兰，聂湘平，魏泰莉，等分子氦和亚硝酸盐对鱼类的危害及其对策的研究J中国水产科学，2004，6 (3)：73775谭树华，罗少安，梁芳，等亚硝酸钠对鲫鱼肝脏过氧化氢酶活性的影响J淡水渔业，2005，35(5)：16186DVORAK P.Selected specificity of aquarium fish 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