外植体及消毒.ppt

外植体的选择及消毒 20130321 上节课小结 组织培养两大最常用激素功能介绍细胞分裂素生长素 植物组织培养基本设备介绍及构成准备室接种室培养室 影响植物组织培养的培养条件 参观植物组织培养室 植物组织培养室直观图 第一节 外植物体的选择 植物细胞具有全能性 理论上任何组织或器官都能成为外植体 但实际上 植物种类不同 同一植株不同器官 同一器官不同生理状态 对外界诱导能力及分化再生能力是不相同的 外植体基因型 外植体取材部位 外植体取材季节 外植体生理状态发育年龄 外植体大小 外植体基因型 基因型不同 组织培养的难易程度也不相同草本植物比木本植物易于组织培养 双子叶植物比单子叶植物易于组织培养 如木本植物中猕猴桃易再生 而松树 柏树难再生 基因型不同 组织培养再生途径不相同十字花科的胡萝卜易于诱导胚状体 茄科的烟草 番茄 曼陀罗易于诱导愈伤组织 因此 外植体选择需要具有明确的目的 选择具有一定代表性的基因型 以提高成功率及实用性 外植体取材部位 不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条件反应是不一致的 有的部位诱导分化率高 有的部位很难脱分化 或者再分化频率很低 甚至只分化出芽不长根或只分化出根而不长芽 如百合科不同属的植物 风信子 虎眼万年青易于再生形成小植株 而郁金香较难 同种百合鳞茎的鳞片外层比内层再生能力强 下段比中上段再生能力强 对大多数植物来讲 茎尖是较好的部位 其形态已基本建成 生长速度快 遗传性稳定 但易受材料来源的限制 因此 茎段 叶片 花粉 胚珠等材料也是常用的取材部位 取材部位选择基本原则 在确定取材部位时 应考虑培养材料有来源有保证 易于再生 成苗 对于培养较困难的植物在培养材料较多的情况下 宜比较各部位的诱导及分化能力 然后择优选择 对培养材料较少的呢 外植体取材部位 外植体取材季节 一般原则 外植体最好在植物生长最适时期取材 即在其生长开始的季节采样 若在生长末期或已经进入休眠期取样 则外植体会对诱导反应迟钝或无反应 如苹果芽在春季取材成活率为60 夏季取材下降到10 冬季取材在10 以下 百合鳞片外植体 春 秋季取材易形成小鳞茎 夏 冬季取材培养 则难形成小鳞茎 马铃薯在4月和12月取的茎外植体有较高的块茎发生能力 而2 3月或5 11月则很少有块茎发生能力 外植体生理状态发育年龄 外植体的生理状态和发育年龄直接影响离体培养过程中的形态发生 一般情况下 越幼嫩 年限越短的组织具有较高的形态发生能力 组织培养越易成功 沿植物的主轴 越向上的部分所形成的器官其生长的时间越短 生理年龄也越老 越接近发育上的成熟 越易形成花器官 反之越向基部 其生理年龄越小 烟草 西番莲的组培中发现 植株下部组织产生营养芽的比例高 而上部组织产生花器官的比例高 木本植物幼龄树的春梢嫩枝段或基部的萌条做外植体效果较好 外植体大小 外植体的大小 应根据培养目的而定 如果是胚胎培养或脱毒 则外植体宜小 如果是进行快速繁殖 外植体宜大 但外植体过大 杀菌不彻底 易于污染 过小离体培养难于操作 成活 一般外植体大小在0 5 1 0cm为宜 具体说叶片 花瓣等约为5mm2 茎段则长约0 5mm 茎尖分生组织带一两个叶原基0 2 0 3mm大小等 小结 外植物的来源是决定植物组织培养成败的一个重要因素 选择适宜的外植体需要综合考虑上述几个方面的因素 同时 还需要考虑外植体的洁净程度 从外界或室内选取的外植体 都不同程度的带有各种微生物 这些污染源一旦带入培养基 便会造成培养污染 因此 选择外植体时 应同时考虑到洁净程度 灭菌和消毒的区别是什么 灭菌 Sterilization 用物理或化学方法 杀死物体表面和孔隙内一切微生物或生物体 即所有生命的物质全部杀死 消毒 Sanitization 杀死 消除或抑制部分微生物 使之不发生作用 第二节 外植体的消毒 湿热灭菌法干热灭菌法除菌滤过法辐射灭菌法环氧乙烷灭菌法 灭菌 Sterilization 灭菌 Sterilization 1 培养基灭菌高压湿热灭菌某些激素 维生素采用过滤灭菌 过滤灭菌 灭菌 Sterilization 2 玻璃器皿灭菌干热灭菌 160 180 1 5 2 0h湿热灭菌 121 15 20min接种前用酒精棉球擦试 并在酒精灯火焰上灼烧灭菌 灭菌 Sterilization 3 接种工具灭菌 用前干热灭菌 160 180 1 5 2 0h 用前湿热灭菌 121 15 20min 接种前用酒精棉球擦试 浸入75 酒精液中 并在酒精灯火焰上灼烧灭菌 灭菌 Sterilization 4 实验服 口罩 滤纸灭菌 湿热灭菌 121 15 20min 实验服灭菌后置于缓冲间或密封好 灭菌 Sterilization 5 接种室灭菌紫外灯照射 接种室 超净台 接种箱 波长260nm 距离小于1 2m 15 20min 臭氧灭菌机 1 2h 熏蒸灭菌 2ml m3甲醛 0 2g m3高锰酸钾 冰醋酸 1 3 高锰酸钾或3 来苏儿 接种台喷雾消毒 75 酒精 灭菌 Sterilization 6 培养室灭菌熏蒸灭菌 2ml m3甲醛 0 2g m3高锰酸钾新建培养室用前一定要彻底熏蒸1次 隔2 5天用洗衣粉水或来苏水拖地1次 用高锰酸钾擦架1次 喷洒75 酒精灭菌降尘 灭菌 Sterilization 消毒 Sanitization 杀死 消除或抑制部分微生物 使之不发生作用 消毒是减少微生物数量 使之达到安全或相对安全的水平 而与使用规定和使用目的相符合 消毒是消灭采自繁殖形态的细胞的活微生物的污染 但它不保证灭菌 消毒和灭菌是不可互换的术语 消毒 Sanitization 常见消毒剂的消毒效果一览表 消毒剂的选择 在选择一种消毒剂时 首先要了解消毒剂的性质 但同时又应认识到没有一种消毒剂是完全理想的 细菌学家建议理想的消毒剂应该具备以下九大特征 如何选择消毒剂 一个原则 既要除去材料上的微生物 又不能伤及材料 消毒剂九大特征 能广谱地杀灭微生物 对人体无毒 无腐蚀性 对设备无污染 具有洗涤剂作用 具有稳定性 作用迅速 不因有机物的存在而失去活性 产生所期望的后效作用 廉价 各种试剂都有优点和局限性 应选择一种试剂或几种试剂结合使用 以最低成本获得最大效果 75 酒精 Alcohol 溶液 体积分数 酒精渗入细菌体内使细菌蛋白质凝固 而被杀死 75 效果最好 使用最多 因为75 能凝固蛋白质 但不会行成包膜 能杀死 高浓度酒精与细菌接触后 使其表面凝固行成包膜 阻碍了酒精凝固其内部蛋白 不能彻底杀死 当酒精浓度低了也起不到相应的效果 常见消毒剂的配制 作用原理及使用 75 酒精溶液配制及贮存以配制一L75 酒精为例 1 L 75 95 X 那么X 0 75 0 95 0 78947 L 即需要加入789 5 mL 95 的灯用酒精 同时加入210 5 mL 的三级水 配制培养基所用水 混合均匀即成 为何选用95 酒精 贮存 密闭保存备用 原因何在 常见消毒剂的配制 作用原理及使用 75 酒精溶液的使用乙醇具有较强的穿透力和杀菌力 在外植体消毒时常作为表面消毒的第一步 时间常为30 45秒 具有浸润和灭菌双重作用 需要结合其他药剂灭菌才能达到彻底灭菌的作用 常见消毒剂的配制 作用原理及使用 0 1 升汞溶液升汞是有剧毒的重金属盐杀菌剂 原理在于Hg2 可与带负电荷的蛋白质结合 使菌体蛋白质变性失活 可有效杀死外植体表面的细菌和真菌芽孢 但需要无菌水冲洗5次以上 以清洗残留的汞 注 1 灭菌后溶液 可倒回原液再次使用 2 灭菌时间需要严格控制 原因 常见消毒剂的配制 作用原理及使用 0 1 升汞溶液的配制和贮存以配制500mL0 1 升汞溶液为例准确称取0 5g升汞 加入预热至90度的500mL三级水中 混匀溶解 封闭贮存 置于角落并在瓶壁上标注危险品标志 常见消毒剂的配制 作用原理及使用 其它灭菌剂 可根据具体实验的需要 查明其作用原理 配制 贮存 使用方法 前处理 获取外植体 酒精灭菌 氯化汞灭菌 无菌水冲洗 接种 外植体灭菌流程图 第三节 外植体的接种 无菌操作 接种时由于有一个敞口的过程 是极易引起污染的时期 这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起 接种室要严格进行空间消毒 接种室内保持定期用1 3 的高锰酸钾溶液对设备 墙壁 地板等进行擦洗 除了使用前用紫外线或臭氧灭菌外 还可在使用期间用75 的酒精或3 的来苏儿喷雾 使空气中灰尘颗粒沉降下来 无菌操作技术分解 1 在接种前20min 打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯 2 超净工作台及紫外灯工作20分钟后 关掉紫外灯 15分钟后可进行操作 3 实验人员先洗净双手 在缓冲间换好专用实验服 并换穿拖鞋等 实验人员衣物带有很多灰尘 在室内走动时 相当于制造 菌雾 因此 进入接种室必须换上专用工作服 头发上的灰尘也很多 因此 应戴上工作帽 4 上工作台后 用酒精棉球擦拭双手 特别是指甲处 然后擦拭工作台面 进入接种室前 操作人员的双手必须进行消毒 首先用肥皂水或洗手液洗净双手 及时剪除较长的指甲 5 先用酒精棉球擦拭接种工具 再将镊子和剪子从头至尾过火一遍 然后反复过火尖端处 对培养皿要过火烤干 无菌操作技术分解 6 接种时 实验人员双手不能离开工作台 不能对着操作区说话 咳嗽和走动等 戴上口罩 帽子 防止由呼吸 说话或咳嗽引起的污染 走动会带来 菌雾 7 接种完毕后要清理干净工作台 可用紫外灯灭菌30min 养成良好的操作习惯 注 若连续外植体接种 每5天要大强度灭菌一次 无菌操作技术分解 DetailistheKeyofSuccess 养成 双手不从开盖瓶口等开放处划过 超净工作台内动作轻 缓 等良好习惯 在无菌操作时 最应该引起警惕的是 双重传递污染 即接种器械被手或其它物品污染后双浸染培养基或试管苗等 接种工具每用一次即需要彻底高温灭菌一次 准备多套接种器械 轮换使用 操作时打开三角瓶或试管 最大污染机会是管口形成负压 空气进入而带来灰尘 因此要求用火焰烧瓶口 杀死菌类 用薄膜做瓶盖时 应该在火焰附近打开盖子 若不用酒精灯接种时 三角瓶或试管应拿成斜角 既已减少灰尘和偶尔存在的细菌落入也便于操作 无菌操作 细节决定成败 培养物污染的原因及预防措施 污染 在组培过程中 由于真菌 细菌等微生物的侵染 在培养容器内滋生大量的菌斑 使培养材料不能正常生长和发育的现象 污染物的长期存在会引起试管苗生活力下降 叶片缺绿 甚至死亡 污染主要原因1 培养基及各种使用器具消毒不彻底 2 外植体灭菌不彻底 3 操作人为因素带入 4 工作区域污染 1 培养基及各种使用器具消毒不彻底培养基在放入超净工作台之前用75 酒精喷洒 以免瓶壁上的大量微生物随气流在操作区内流动盘旋 同时操作区内 不宜放入过多待用培养基 接种工具每用一次即需要彻底高温灭菌一次 准备多套接种器械 轮换使用 以减少 交叉污染 培养物污染的预防措施 2 外植体灭菌时不彻底经表面消菌的材料 并不一定完全将微生物杀死 有相当多的材料仍是带菌的 这些个体在培养三天左右就开始长菌 需要及时进行检查和淘汰 否则还会传染其他个体 选择适宜的灭菌剂 筛选恰当的灭菌时间 增加前处理 加入表面活性剂 几种消毒剂配合使用 二次灭菌 培养基中加入抗生素 培养物污染的预防措施 抗生素 antibiotic 抗生素 Antibiotic 的定义是微生物 例如 放线菌 的代谢产物或合成的类似物 在体外能抑制微生物的生长存活 而对宿主不会产生严重的副作用 亚历山大 弗莱明 1921年 发现了溶菌酶 1929年6月发表 关于霉菌培养的杀菌作用 并因此获诺贝尔奖 对宿主无害 细菌是原核生物 其细胞壁的结构和组成成分与人体的不同 格兰氏阳性菌细胞壁成分是肽聚糖和磷壁酸 格兰氏阴性菌细胞壁成分是类脂和蛋白 而人类则是磷脂 蛋白质 与菌类不同种类的 和多糖 抗生素有针对性的 不会杀死正常体细胞 抗生素作用原理 1 干扰细菌的细胞壁的合成 使细菌因缺乏完整的细胞壁 抵挡不了水份的侵入 发生膨胀 破裂而死亡 如青霉素2 使细菌的细胞膜发生损伤 细菌因内部物质流失而死亡 如多粘菌素3 阻碍细菌的蛋白质合成 使细菌的繁殖终止 如氯霉素 四环素4 改变细菌内部的代谢 影响它的脱氧核糖核酸的合成 使细菌 还有肿瘤细胞 不能重新复制新的细胞物质而死亡 如灰黄霉素 植物组织培养常用抗生素 头孢噻肟钠 CefotaximeSodium 抑制细胞壁合成 卡那霉素 Kanamycin 干扰蛋白质的合成 硫酸链霉素 StreptomycinSulfate 干扰蛋白质合成 3 操作人为因素带入接种者应养成良好的无菌操作习惯 熟练掌握无菌操作技术 做到操作娴熟 干练 以减少人为因素造成的污染 培养物污染的预防措施 标准无菌操作图解 烤瓶口 取苗 取苗要小心 瓶口不能冲向自己 要冲向风源 镊子取苗要轻 不能撤带 杀死可能存留在瓶口处的菌体 防止菌带入 接苗前 先烤瓶口 倒掉培养瓶存留的水珠 以防湿度大出现玻璃化 标准无菌操作图解 切苗三字决 快 狠 准 接苗是要注意瓶口冲向风源 尽量靠近风源 不能拉到怀里 标准无菌操作图解 4 工作区域污染当在培养基上出现不同颜色的霉菌污染 就是因为无菌操作室和培养室的空气污染造成的 必须在接种前用紫外线或臭氧对空气进行消毒 定期对接种室或培养室进行消毒 对超净工作台用75 进行消毒 使用之前提前开机 风机 紫外线 使用3月以上应对超净工作台的滤网进行检查 培养物污染的预防措施 第四节 外植体的褐化及预防 定义 外植体在诱导脱分化或再分化过程中 自身组织从表面向培养基释放褐色物质 以及培养基逐渐变成褐色 外植体也变褐至死亡的现象 外植体的褐化的原因 很多植物都含有较多的酚类化合物 这些酚类化合物在完整组织和细胞中与多酚氧化酶分隔存在 因而比较稳定 在细胞受到伤害时 这种分隔效应被打破 酚类化合物外溢 与多酚氧化酶接触 而氧化成褐色的醌类物质和水 与外植体组织中的蛋白质发生聚合 进一步引起其他酶系统失活 从而导致组织代谢活动紊乱 生长停滞 1 种类和基因型 2 生理状态 来源 大小 3 培养基成分 4 培养条件 5 材料继代时间 外植体的褐化的原因 1 植物种类和基因型一般来说 木本植物 单宁或色素含量高的植物容易发生褐变 外植体的褐化的原因 2 生理状态 来源 大小幼龄材料一般比成龄材料褐变轻 幼龄材料酚类化合物含量少 同一材料冬 春季取材褐变死亡率最低 其他季节取材则不同程度的增加 植物体内酚类含量和多分氧化物活性有季节性变化 小的材料更易发生褐变 相对较大的材料则褐变较轻 切口越大 褐变越严重 除机械损伤外 各种消毒用的化学试剂对外植体的伤害也会引起褐化 外植体的褐化的原因 3 培养基成分初代培养时 培养基中无机盐浓度过高可引酚类化合物的大量产生 导致外植体褐变 液体培养基可有效克服外植体褐变 在培养基中加入一些抗氧化物和其他抑制剂 如盐酸半胱氨酸 抗坏血酸 硫代硫酸钠或柠檬酸等 在培养基中加入0 5 1 的活性炭 用以吸附褐变产生的有害物质 从而减轻褐变 外植体的褐化的原因 4 培养条件光照 采取外植体前 如果将材料或母株进行遮光处理 然后再切取外植体 能有效抑制褐化 无光抑制褐化原理是由于在氧化过程中 许多反应受酶系统控制 而酶系统活性受光照影响 温度 高温促进酚氧化 而低温抑制酚类化合物氧化 降低多酚氧化酶活性 从而减轻褐化 外植体的褐化的原因 5 材料继代时间将培养物不断转移到新鲜培养基上 以消除有害物质的累积造成的危害 如初代培养后 发现有较严重褐化现象 可及时将其继代至新鲜培养基中 外植体的褐化的原因 外植体褐化的预防 对症下药 多管齐下 第五节 玻璃化的原因及预防 定义 植物材料离体繁殖时 有些培养基的嫩茎 叶片往往会出现半透明状和水渍状 这种现象称为玻璃化 玻璃化苗的特点 叶 嫩梢呈水晶透明或半透明 植株矮小肿胀 失绿 叶片皱缩成纵向卷曲 叶表缺少角质层蜡质 没有功能性气孔 体内含水量高 但干物质 叶绿素 蛋白质 纤维素和木质素含量低 吸收营养与光合功能不全 分化能力大大降低 苗生长缓慢 繁殖系数大为降低 甚至死亡 生根困难 移栽成活率低 玻璃化的危害 大大降低了试管苗有效增殖系数 严重影响了试管苗质量 造成人 财 物的极大浪费 必须对玻璃化加以控制 玻璃化的原因 组织培养过程中的环境变化引起 导致玻璃化的因素有以下几方面 1 激素浓度 尤其CTK 增加或CTK IAA高 2 琼脂浓度 3 光照 4 温度 5 湿度 6 培养基离子种类及比例不适宜 7 继代次数 1 激素浓度 尤其CTK 增加或CTK IAA高高浓度的细胞分裂素有利于促进芽的分化 也会使玻璃化的发生比例提高 细胞分裂素与生长素的比例失调 细胞分裂素的含量显著高于两者之间的适宜比例时 使组培苗正常生长所需的激素水平失衡 导致玻璃化的产生 玻璃化的原因 2 琼脂浓度随琼脂浓度的增加