茶叶科学发表论文(固态发酵).pdf

茶茶 叶叶 科科 学学 2005 25 4 300 306 Journal of Tea Science 收稿日期 收稿日期 2005 04 15 修订日期 修订日期 2005 07 16 基金项目 基金项目 云南省自然科学基金重点项目资助 编号 2003C0007Z 作者简介 作者简介 龚加顺 1971 男 云南富源人 博士 博士后 副教授 主要从事普洱茶和食品生物技术研究 云南晒青绿毛茶的微生物固态发酵及成分变化研究云南晒青绿毛茶的微生物固态发酵及成分变化研究 龚加顺1 周红杰2 张新富1 宋姗1 安文杰2 1 云南农业大学食品科技学院 云南 昆明 650201 2 云南农业大学茶学系 云南 昆明 650201 摘要 摘要 研究了添加外源优势菌种固态发酵云南晒青绿茶过程中主要成分的变化规律 结果表明 随着发酵时间 的延长 主要的化学品质成分含量均发生了明显变化 以多酚类 儿茶素 茶红素 茶褐素 寡糖和多糖的变 化最明显 发酵 40 天后 多酚类物质下降了约 60 儿茶素类下降了 80 黄酮类下降了 55 茶红素下降 了 90 水溶性寡糖下降了 65 水浸出物下降了 25 而茶黄素 水溶性总糖和灰分的变化不大 但茶褐 素类物质增加了 4 5 倍 水溶性多糖也增加了 5 7 倍 这说明多酚类物质 儿茶素 茶红素 茶褐素类 寡糖 及多糖类物质可作为云南普洱茶的特征成分用于品质判定 实验结果还表明 利用优势菌种发酵晒青绿茶可以 在短时间内生产熟普洱茶 其理化成分含量可达到陈年普洱茶的水平 实验结果同时还表明 离开了微生物和 湿热作用 晒青绿茶是难以形成普洱茶特有品质风格的 关键词关键词 晒青绿茶 普洱茶 黑曲霉 固态发酵 成分变化 中图分类号 中图分类号 TS272 5 1 Q936 文献标识码 文献标识码 A 文章编号 文章编号 1000 369X 2005 04 300 07 Changes of Chemical Components in Pu er Tea Produced by Solid State Fermentation of Sundried Green Tea GONG Jia shun1 ZHOU Hong jie2 ZHANG Xin fu1 SONG Shan1 AN Wen jie2 1 Faculty of Food Technology Yunnan Agricultural University Kunming 650201 China 2 Department of Tea Science Yunnan Agriculture University 650201 Kunming China Abstract The changes of chemical components of Pu er tea produced by solid state fermentation SSF of sundried green tea using Aspergillus niger were studied in this paper The results showed that the main chemical components of sundried green tea such as polyphenols catechins thearubigins flavonoid theabromine polysaccharide and oligosaccharide were converted obviously during SSF process of sundried green tea When the sundried green tea was fermented for 40 days the content of polyphenols catechins flavonoid thearubigins soluble oligosaccharide and tea extracts of the fourth pile sample were reduced 60 80 55 90 65 and 25 respectively but the content of theabromine and soluble polysaccharide increased by 4 5 times and by 5 7 times respectively It was suggested that the polyphenols catechins thearubigins theabromine oligosaccharide and polysaccharide of Pu er tea could be used as characteristic components to determine the quality of Pu er tea The results also demonstrated that the esculent Pu er tea was produced within short time by SSF of sundried green tea and the product had the same content of characteristic components as the Pu er tea stored for long time Furthermore the results revealed that the sundried green tea could not be transformed the characteristic quality of Pu er tea without the process of microorganism Key words Sundried green tea Pu er tea Aspergillus niger Solid state fermentation Change of components 4 期 龚加顺 等 云南晒青绿毛茶的微生物固态发酵及成分变化研究 301 云南普洱茶是以云南大叶种茶树的鲜叶 经杀青 揉捻 日晒等工序制成的晒青绿毛茶 为原料 再经发酵 蒸揉 成型制成各种形状 的成品普洱茶 早在 20 世纪 60 年代就已开始 研究普洱茶的品质化学 许多学者对其化学成 分及其在加工过程中的变化规律与普洱茶品 质的关系作了研究报道 1 3 但因系统研究不 足 到目前为止 尚不能对普洱茶形成机理作 系统而又全面的解释 渥堆 工艺历来被认为是普洱茶品质形 成的最关键工序 有关 渥堆 的理论也有大 量报道 4 6 笔者认为从 渥堆 的角度很难 将其形成机理阐述清楚 如果从微生物固态发 酵的角度 更易阐明普洱茶形成的化学机制 微生物的固态发酵 Solid State Fermentation SSF 是指在没有自由水的存在下 微生物在 底物上生长的过程 固态发酵过程是需要水的 存在 但这种水是以复合或吸附的形式存在基 质的内部 基质的水分不能低于 12 7 当晒 青绿毛茶经潮水至必要的含水量后 接种优势 菌种即可进行固态发酵 在这种发酵环境中 茶叶就是发酵基质 本研究利用自制的微生物优势菌种 以云 南晒青绿毛茶为主要原料 进行微生物固态发 酵转化以获得品质较优的普洱茶 并对发酵过 程中主要化学成分的转化变化规律进行研究 为普洱茶品质标准的制定和规范普洱茶加工 工艺奠定基础 1 材料与方法 1 1 实验材料实验材料 优势黑曲霉菌种 利用平板分离的方法 从普洱茶自然发酵中期的翻堆样中分离纯化 而得 至今已成功应用于普洱茶的发酵生产 并已申请专利 云南晒青绿毛茶 昆明西山顺德茶厂提供 1 2 实验方法实验方法 1 2 1 晒青绿毛茶的固态发酵 将 2 吨晒 青绿毛茶原料潮水至含水量高于 15 后 在封 闭的发酵室内接种优势黑曲霉菌种 拌和均匀 进行发酵 接入菌种量 1000 g 预先混入水 中 发酵初始温度为 25 空气相对湿度 85 在发酵过程中 每 10 天翻一次堆 并 取样分析 1 2 2 多酚类测定 8 酒石酸铁比色法 茶叶原料 去离子水浸泡 3hr 加热煮沸 90 保温 2hr 过滤 滤液浓缩 氯仿萃取 1 1 水层 乙酸乙酯萃取 测定 重复 测定三次 1 2 3 黄酮类测定 8 槲皮素比色法 以 槲皮素为标准品 采用 70 乙醇回流提取 原料 打碎 70 乙醇 浸泡 24 小时 70 C 水浴锅提取 3 小时 过滤 滤液蒸发弃酒精 氯仿萃取 水层 乙酸乙酯萃取 浓缩 测定 重复测定 三次 1 2 4 总儿茶素类测定 9 香荚兰比色法 标准溶液为 catechin 重复测定三次 1 2 5 水浸出物测定 参照文献 9 重复 测定三次 1 2 6 灰分测定 参照文献 9 重复测定 三次 1 2 7 水分测定 参照文献 9 重复测定 三次 1 2 8 茶红素 茶黄素 茶褐素比色测定 9 分光光度法 重复测定三次 1 2 9 总糖测定 10 蒽酮 硫酸比色法 葡萄糖为标准品 重复测定三次 1 2 10 水溶性寡糖的测定 10 采用Roe比 色法 以蔗糖为标准品 重复测定三次 1 2 11 水溶性多糖的测定 10 蒽酮硫酸 法 葡聚糖 Dextran 为标准品 分子量 10000 重复测定三次 茶叶多糖的提取 取 10 普洱茶用 100ml 蒸馏水浸提 12 后过滤 残渣加蒸馏水 50ml 继续浸提 5 h 搓揉过滤 去沉淀 合并滤液 向 滤液中加入无水乙醇至乙醇浓度为 80 间歇 茶 叶 科 学 25 卷 302 搅拌 5 后 进行离心分离沉淀 弃上清液得灰 褐色茶叶粗多糖 用蒸馏水溶解后比色法测 定 1 2 12 蛋白质含量测定 11 采用Lowry 测定法 即Folin 酚测定法 采用牛血清白蛋 白作标准蛋白 重复测定三次 2 结果与分析 2 1 云南晒青绿毛茶的微生物固态发酵云南晒青绿毛茶的微生物固态发酵 晒青绿毛茶随着固态发酵时间的延长 茶 叶外形和内质均发生了较大变化 见表 1 发酵 40 天后 色泽由黄绿色变为猪肝色 条 索则变得更紧结 香气由原来的略带烟味变为 陈香味 滋味更加醇和 汤色红亮 表 1 结果 还显示 经过 40 天的发酵转化 形成的普洱 茶在色 香 味 形等方面都已达到了陈年茶 的效果 这表明利用优势菌种固态发酵可以加 速晒青绿茶原料的生物转化 表表 1 云南晒青绿毛茶固态发酵前后与陈年普洱茶的感观审评结果云南晒青绿毛茶固态发酵前后与陈年普洱茶的感观审评结果 Table 1 Results of sensory evaluation of sundried green tea by SSF and Pu er tea stored for long time 外形 Appearance 内质 Quality 样品 Sample 条索 色泽 香气 滋味 汤色 叶底 生产日期 Production date 原料 Raw material 疏松 黄绿 稍带烟气 味涩 橙黄透亮 黄绿有红梗 2004 一翻混合样 10d Mixed tea of first pile 松稍毫 褐绿 清香 甜醇尚涩 橙黄透亮 褐绿 2004 二翻混合样 20d Mixed tea of second pile 松 稍卷 褐色 清香带甜味苦涩 褐黄透亮 褐黄 2004 三翻混合样 30d Mixed tea of third pile 欠紧结 棕褐带灰色 糯米香 尚涩 尚红亮 棕褐 2004 四翻混合样 40d Mixed tea of fourth pile 紧结 猪肝色 陈香 醇和 红亮 猪肝色 2004 勐海茶厂精装茶 Menghai pu er tea 紧结重实 猪肝色 陈香味浓 带纸味 醇和 橙红明亮 红褐明亮 1980 云南普洱 8 级 Yunnan pu er tea 8 class 重实肥硕 猪肝色泛灰 略霉 醇和回甘 陈香显著 清澈明亮 猪肝色花杂 1984 勐海 79072 Menghai 79072 紧结欠重实 猪肝色 陈香 醇和 红浓明亮 红褐明亮 1989 普洱茶 75671 Pu er tea 75671 紧结重实 猪肝色带灰 陈香 醇和 红亮 红褐明亮 1992 云南七子饼茶 Yunnan chitsu pingcha 圆饼 暗淡 陈香带酸气醇和 红亮 棕褐色匀嫩 1997 云南七子饼茶 Yunnan chitsu pingcha 圆饼 乌润有光泽 陈香 醇和 红亮 棕褐色 1998 2 2 云南晒青绿毛茶在固态发酵过程中的云南晒青绿毛茶在固态发酵过程中的 成分变化成分变化 在微生物的固态发酵作用下 晒青绿毛 茶发生了大量生物转化变化 形成了普洱茶 特有的品质特征 表 2 的结果显示 在固态 发酵过程中 大量的多酚类 儿茶素 黄酮 类物质 茶红素和水溶性寡糖均大幅度下降 其中 多酚类物质下降了约 60 儿茶素类 下降了 80 黄酮类下降了 55 茶红素下 降了 90 水溶性寡糖下降了 65 水浸出 物下降了 25 但茶褐素类物质增加了 4 5 倍 水溶性茶多糖也增加了 5 7 倍 而茶黄素 水溶性总糖和灰分则变化不大 正是这些物 质在微生物的转化作用下发生了激烈的生化 变化 从而形成了普洱茶红褐明亮 滋味纯 厚 回甘的品质特征 因此 在固态发酵形 成的普洱茶中 多酚类物质 儿茶素 茶红素 茶褐素类 寡糖及多糖类物质可作为其特征 成分用于品质判定 4 期 龚加顺 等 云南晒青绿毛茶的微生物固态发酵及成分变化研究 303 表表 2 晒青绿毛茶与翻堆样的化学成分含量晒青绿毛茶与翻堆样的化学成分含量 Table 2 Content of chemical components of sundried green tea and different upturned tea in the pile fermentation of Pu er tea 单位 以干基计 成分含量 Content of components 样品及发酵时间 Samples and fermenting time TP TC FL TF TR TB TS TPSTOS TE Ash 晒青原料 混合样 Raw material 35 32 10 501 680 187 232 30 9 35 0 397 11 38 90 5 30 一翻中心样 10d Central tea of first pile 31 05 9 07 1 460 164 002 35 8 88 0 606 51 35 60 5 53 一翻混合样 10d Mixed tea of first pile 33 3 9 84 1 600 176 412 25 9 12 0 376 51 34 60 5 60 二翻上层样 20d Surface tea of second pile 24 19 8 12 1 390 174 613 75 8 31 0 946 43 35 53 5 99 二翻中心样 20d Central tea of second pile 30 13 7 23 1 580 156 063 23 8 79 1 275 49 34 39 5 44 二翻下层样 20d Lower tea of second pile 26 85 7 44 1 420 165 304 14 8 39 1 284 87 31 40 5 34 二翻腐底 20d Cankered bottom tea of second pile 26 45 6 64 1 560 164 804 37 8 79 1 494 53 36 67 5 64 三翻上层样 30d Surface tea of third pile 18 60 7 73 1 130 132 345 71 9 19 2 254 57 33 40 5 53 三翻中心样 30d Central tea of third pile 26 91 5 91 1 420 154 541 93 10 022 435 18 32 89 5 30 三翻底层样 30d Bottom tea of third pile 26 52 6 40 1 360 164 764 14 8 72 1 374 42 31 82 5 22 三翻混合样 30d Mixed tea of third pile 26 52 5 88 1 360 164 974 74 10 242 144 27 34 93 5 39 四翻上层样 40d Surface tea of fourth pile 12 45 1 97 0 590 100 2813 748 62 3 192 18 26 00 5 90 四翻中心样 40d Central tea of fourth pile 11 18 1 04 0 790 110 0111 637 78 3 091 66 24 53 5 70 四翻下层样 40d Lower tea of fourth pile 13 92 1 90 0 640 120 2612 458 48 3 792 97 27 00 6 12 注 TP 为茶多酚 TC 为儿茶素总量 FL 为黄烷酮 TF 为茶黄素 TR 为茶红素 TB 为茶褐素 TS 为总糖 TPS 为茶多糖 TOS 为寡糖 TE 为茶提取物 下同 Note TP Tea Polyphenols TC Total Catechins FL Flavone TF Theaflavins TR Thearubigins TB Theabromine TS Total Sugar TPS Tea Polysaccharide TOS Tea Oligosaccharide TE Tea Extract Same as follow tables 表表 3 固态发酵茶与陈年普洱茶的理化成分比较固态发酵茶与陈年普洱茶的理化成分比较 Table 3 Comparison of the content of chemical components in different Pu er tea and sundried green tea by SSF 单位 以干基计 unit 成分含量 Content of components 样品 Sample TP TC FL TF TR TB TS TPS TOS TE Ash 云南普洱 8 级 1984 Yunnan pu er tea 8 class 14 34 1 98 3 77 0 27 4 52 9 21 11 15 3 39 3 49 30 51 5 10 云南普洱 79072 1989 Yunnan pu er tea 12 92 2 04 3 31 0 23 3 44 8 27 9 51 2 64 2 59 24 19 5 80 云南七子饼茶 1997 Yunnan chitsu pingcha 12 11 1 35 2 49 0 17 1 98 9 75 8 65 2 63 2 31 36 62 7 16 云南七子饼茶 1998 Yunnan chitsu pingcha 12 34 1 48 3 52 0 16 2 42 8 93 8 67 2 61 2 29 36 66 7 09 四翻混合样 40d Surface tea of fourth pile 12 52 1 64 0 67 0 11 0 18 12 61 8 29 3 36 2 27 25 84 5 91 茶 叶 科 学 25 卷 304 2 3 固态发酵茶与陈年普洱茶的理化成分比较固态发酵茶与陈年普洱茶的理化成分比较 从表 3 的结果可以看出 固态发酵茶的多 酚类 儿茶素 黄酮 茶黄素 茶红素 总糖 等的含量均低于陈年普洱茶 20 年 15 年 多糖 寡糖的含量差异不大 但固态发酵茶的 茶褐素的含量远远高于陈年普洱茶 这表明在 优势菌种的生物转化下 在短时间内也能使晒 青绿茶达到与陈年普洱茶基本相同含量的有 效成分 这意味着晒青绿茶发酵时间太长或成 品普洱茶贮藏时间过长均不利于功效成分的 保留 因此 从普洱茶的功能品质来讲 并不 是越长越好 应有一个最佳饮用期限 3 讨论 3 1 微生物的发酵作用是必要条件微生物的发酵作用是必要条件 上述结果表明 微生物对普洱茶的品质形 成发挥了重要作用 但从陈年晒青绿茶化学成 分与感官品质分析结果来看 表 4 5 离开 微生物的发酵作用 即使储藏很长时间也难形 成普洱茶应有的品质特征 而且在实际发酵过 程中 如果优势菌种的接种量不足 也难达到 陈年普洱茶的水平 表 6 这说明微生物的 发酵作用是云南普洱茶品质形成的必要条件 3 2 固态发酵过程理化成分变化的机理固态发酵过程理化成分变化的机理 何国藩等从渥堆叶片组织的显微结构变 化证明 微生物分泌酶及代谢产生热量对茶叶 内含物的氧化还原反应以及普洱茶品质形成 起到重要的作用 刘勤晋与陈宗道等的研究均 提出微生物分泌的胞外酶 多酚氧化酶 抗坏血 酸酶等 及呼吸代谢产生的热量对普洱茶的品 质形成起着相当重要的作用 1 由于黑曲霉能 产生多种水解酶 有葡萄糖氧化酶 纤维素酶 表表 4 陈年晒青绿茶中的化学成分陈年晒青绿茶中的化学成分 Table 4 Content of chemical components of sundried green tea stored for 16 years 单位 unit 成分含量 Content of components 样品 Sample TP TC FL TF TR TB TS TPS TOS TE Ash 晒青一级 1989 Sundried green tea No one class 1989 26 43 5 22 0 98 0 166 91 3 53 8 07 0 47 4 06 29 59 5 10 晒青九级 1989 Sundried green tea No nine class 1989 25 58 9 00 1 82 0 2511 05 3 28 10 55 0 50 4 21 36 95 4 80 晒青十级 1989 Sundried green tea No ten class 1989 24 14 8 33 1 97 0 2612 53 3 43 11 94 0 62 4 34 29 92 4 40 表表 5 陈年晒青绿茶的感观审评结果陈年晒青绿茶的感观审评结果 Table 5 The results of sensory evaluation of sundried green tea stored for 16 years 外 形 Appearance 内 质 Quality 样品 Sample 条 索 色 泽 香 气 滋 味 汤 色 叶 底 生产日期 Production date 晒青一级 1989 Sundried green tea No one class 1989 紧直 显毫 褐黄 尘味带纸味 醇滑带 烟味 清 澈 明 亮 绿 中泛黄 绿中带褐 1989 晒青九级 1989 Sundried green tea No nine class 1989 紧直 带黄片 褐黄 尘味带烟味滑 微酸 清 澈 明 亮 绿 中泛黄 绿中泛红 1989 晒青十级 1989 Sundried green tea No ten class 1989 松 褐黄 尘气带烟味醇滑微涩 清 澈 明 亮 绿 中泛黄 绿中泛红 1989 4 期 龚加顺 等 云南晒青绿毛茶的微生物固态发酵及成分变化研究 305 表表 6 原料与翻堆样的化学成分含量 微生物接种量为原料与翻堆样的化学成分含量 微生物接种量为 200g t Table 6 Content of chemical components of different upturned tea in the pile fermentation process and raw material inoculum of Aspergillus niger 20g t 单位 unit 成分含量 Content of components 样品 Sample and fermenting time TP TC FL TF TR TB TS TPS TOS TE Ash 原料 0d Raw material 26 13 9 93 2 01 0 29 10 032 99 9 54 0 25 6 83 31 695 20 一翻 10d First tea pile 25 95 9 02 2 03 0 25 7 64 2 92 9 36 0 78 5 18 33 665 40 二翻 20d Second tea pile 23 27 7 39 1 74 0 26 6 98 3 88 8 82 0 94 4 83 35 485 50 三翻 30d Third tea pile 20 98 5 63 1 49 0 22 6 00 5 00 9 56 1 56 5 47 29 435 70 四翻 40d Fourth tea pile 17 90 3 30 1 11 0 20 3 75 6 96 9 86 1 67 5 50 29 045 90 3 3 2 3 4 3 6 3 8 4 4 2 可溶性蛋白含量 Content of soluble protein 0d10d20d30d40d 发酵时间 Fermentation time 图1 晒青绿茶固态发酵过程中可溶性蛋白的变化图1 晒青绿茶固态发酵过程中可溶性蛋白的变化 Fig 1 Variation of soluble protein during SSF of sundried green tea 0 0 5 1 1 5 2 2 5 多糖与结合蛋白的含量 Contents of soluble polysaccharides and protein 0d10d20d30d40d 发酵时间 Fermentation time 图2 晒青绿茶固态发酵过程中可溶性多糖及与 多糖复合的蛋白含量变化 图2 晒青绿茶固态发酵过程中可溶性多糖及与 多糖复合的蛋白含量变化 Fig 2 Variation of soluble tea polysaccharides and protein complexed polysaccharides during SSF of sundried green tea Soluble