电子显微技术 复习文稿.docx

电子显微技术课程 复习文稿目 录： 教学大纲1.电子显微镜技术简介：细胞形态观察方法、简史、使用2.扫描电子显微镜：结构、原理、样品制备3.透射电子显微镜：结构、原理、使用4.透射电镜样品包埋块制作：取材、固定、漂洗、脱水、浸透、包埋5.超薄切片和切片染色：切片刀具、修整包埋块、载网、支持膜、切片、染色、负染色6.免疫电子显微镜术：胶体金标记技术、抗原抗体、样品制备、免疫染色7.生物样品的超微结构及其分析一、光学显微镜技术（light microscopy)：1.荧光显微镜技术：特异蛋白质等生物大分子的定性定位 直接荧光：线粒体：绿色荧光； 溶酶体：红色荧光间接荧光：绿色荧光蛋白GFP的应用：泛素蛋白GFP在胞间连丝的定位2.激光共聚焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy）：构建样品三维结构、增强反差提高分辨率3.相差显微镜（phase-contrast microscope）：将光程差或相位差转换成振幅差，用于观察活细胞4.微分干涉显微镜：（differential interference contrast microscope, DIC）：样品中厚度上区别转化成明暗区别，增加样品反差更立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器小结： 光镜的最大分辩率约为0.2m ，有效放大倍数约1000倍。 用途概况：用于细胞拆合、向核内注入基因、向细胞内注射药物,抗体或荧光标记物质。显微操作技术是研究核质关系、细胞内某种蛋白质功能和细胞间物资运输等基础研究的重要手段，也是转基因动物、高等动物克隆方面的主要手段。 光镜的用途：细胞形态和结构观察；组织学研究：细胞位于器官的部位；定位研究，物质存在的细胞；在细胞内的哪些部位；你所研究的结构（如细胞骨架）在细胞中的立体分布；培养细胞的活细胞观察（如Mt的动态）；野生型和突变体的组织学比较二、电子显微镜技术(Electron microscopy)：用电子束成像的显微镜称为电子显微镜，具有较高的分辨力和放大倍数。1.扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscopy SEM)：a.形成三维立体图像，应用观察样品的表面形貌，及晶体学和样品形态分析。 b.基本结构（形态图）：样品室、真空及电气系统电子光学系统：电子枪形成扫描电子束、电磁透镜、扫描偏转系统电子讯号收集、处理和显示系统：二次电子收集样品室、真空及电气系统：c.图像分辨率及放大率：70-100，景深、放大倍率d.常规样品制备：样品表面清洁固定（甲醛+戊二醛）脱水（梯度浓度乙醇/丙酮）干燥（冰冻干燥法/临界干燥）金属喷涂(离子溅射法)2.透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy TEM)：主要用于观察样品的超微结构a. 原理：电子束经聚光镜会聚形成光斑，照射到样品上穿过的电子由物镜两次放大成像，并投射到荧光屏上，最终形成人眼可见的影像。分为高压电镜（加速电压100 500kV）和超高压电镜（加速电压00-3000kV）。b. 基本结构说明光源：钨灯丝，电子波长与加速电压的平方根成反比。电磁透镜电镜放大倍数的调节：调节透镜线圈电流改变透镜磁场强度，从而改变放大倍数。 电子束与样品的相互作用：电子束照射在样品上时，能穿过极薄样品而得到透射电子，照射在荧光体上能发出可见光，在荧光屏上形成图象。c.基本结构：照明系统（电子枪）、聚光镜、光阑、成像系统（物镜、中间镜、投影镜称为电镜的三级透镜）、观察记录系统（观察窗、荧光屏、照相底片）、真空系统、电源系统d.操作选择：加速电压（60KV或80KV）、物镜（孔径较小的光阑）、放大倍数（尽可能大）、曝光时间（2-5秒）、焦距调整。3. 透射电子显微镜常规样品制备：a.超薄切片质量判断：样品厚度在1000以下的切片，切片有硬度有厚度，有足够的反差。样品真实，厚度60-100nm，样品的反差（对光吸收强度不同）。b.固定：动物组织材料：灌注固定和浸入固定体外培养细胞：单层细胞、悬浮培养细胞离心法、琼脂铸模法双重固定固定标准：据细胞超微结构形态判断超薄切片样品结构是否保存良好。 细胞基质：颗粒细腻，不应出现任何空白区域。 细胞膜：具有连续性，三层结构清晰，无失真和断裂。 高尔基体：膜应完整。 线粒体：既无肿胀也无收缩，外膜完整，基质致密。 粗面内质网：呈多层次、板层状排列，其外表面附着核糖体。 细胞核双层膜：完整并基本平行，核孔明显。 对于某些泡状结构：应看到由单层膜包裹，膜结构清晰、无断裂现象。影响固定的因素： 固定液渗透速率：快速将组织细胞杀死。 固定液浓度：锇酸浓度的限制较为严格，戊二醛固定液浓度控制范围为1.5-5。 固定温度和时间、组织块大小、缓冲液 固定液pH：pH为6.8-7.2。 固定液渗透压：渗透压略高一点的固定液。c.具体步骤： 取材与固定：取材1-3mm3 ，4下操作，固定剂：戊二醛+多聚甲醛、高锰酸钾、锇酸 漂洗与脱水：磷酸盐缓冲液或二甲砷酸盐缓冲液（pH6.8-7.4），漂洗组织2-3次，时间需20-30min。材料在梯度浓度乙醇30、50、70、80、95和 100中依次脱水，再用环氧丙烷置换乙醇。 浸透与包埋：包埋剂逐渐取代组织中脱水剂，包进剂为树脂、硬化剂、增塑剂及催化剂4种试剂按一定比例配制，环氧树脂类如Spurrs、Epon；包埋模具：凹槽状包埋模板、胶囊，再烘箱中聚合。 超薄切片：包埋块修整、切片、沾片、贴膜等过程。 玻璃刀制备：规格通常为402.50.65cm，三角形右侧大多有锯齿，石蜡缝隙密封。（钻石刀） 修整包埋块：四个侧面使其成为椎体，顶部呈梯形或长方形、正方形。 载网：载网外径通常为3.05mm，厚度约0.02mm，铜网、镍网、银网、金网等，旧铜网回收。 支持膜：厚约20nm，Formvar膜（聚乙烯醇缩甲醛）、碳膜 漂膜、摆网、捞膜 切片：由超薄切片机完成，自动进刀方式可分为热胀式和机械式两种。 染色：醋酸双氧铀、柠檬酸铅，重金属盐染色呈现黑白对比度 电镜观察4. 常用透射电镜技术：1.免疫电镜技术(immunoelectron microscopy) a.原理：将免疫学方法与电镜技术相结合，利用抗原(Antigen)与抗体(Antibody)高度特异性结合的特点，用标记的抗体对细胞表面或细胞内部的相应抗原进行定性、定位或半定量测定。 抗原：蛋白质、核酸、酶、激素、多糖、磷脂、受体、病原体均可作为抗原。 抗体：B淋巴细胞产生的糖蛋白，并使抗原失活的免疫球蛋白(Ig)，按分子结构分为 IgG，IgM，IgA，IgD，IgE五大类，对IgG结构和功能研究的最为清楚。 b.操作步骤 1). 抗原的提取和纯化细胞粉碎提取纯化浓缩和干燥保存，如蛋白质、核酸等皆有成熟的提取方法。2). 抗体的制备和提取 抗原+佐剂（能增强抗原抗原性的物质，以刺激机体产生较强的免疫反应）注射入动物体内，经一段时间内，采集动物血液，自然析出血清，称抗血清，测定抗血清的效价、特异性、亲合力等，然后纯化抗体。3). 细胞超薄切片的制备 固定：4%多聚甲醛加0.1%戊二醛，一般不用锇酸。包埋：水溶性树脂包埋，如Lowicryl K4M、LR White。切片：超薄切片或直接进行冰冻切片。4). 免疫染色直接法，间接法 5). 电镜观察2.负染色技术(nagtive stain technique)a.原理：用高密度的重金属物质作负染剂（磷钨酸、醋酸铀等）负染剂一般沉积在样品的周围，使样品的背景呈电子不透明的黑色，样品的凸出部位则较少染料沉积，样品处呈电子透明的白色，从而显示出被检物的形状、大小和表面结构。b.染液种类：磷钨酸、醋酸双氧铀和钼酸胺最为常用。c.步骤方法：载网滴染法、漂浮法，应设置对照样品染色。小结：电子显微镜以电子束为光源，波长与发电压的平方根成反比，也就是说电压越高，波长越短。用途概况：超微结构学：用以研究细胞内亚单位或细胞器的精细结构如细胞核、线粒体、叶绿体，生物膜等病毒学：检查发现病毒，测量大小，观察结构的粒体组成，亚单位的数量和特性，侵入细胞方式等，分子生物学方面：利用电镜研究蛋白质（酶）核酸的分子结