LAMP实验简介.doc

通过LAMP实现DNA的线性扩增一、 LAMP 原理60-65是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。LNMP学习 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3 末端的Fl区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。LNMP学习 二、实验流程二、 阶段实验及需要解决的问题(一) 实验准备阶段1、引物设计2、模板中引入合适的酶切位点3、不同梯度拷贝数模板的准备4、反应仪器的准备5、具有链置换活性的DNA聚合酶的选择6、扩增产物的检测方法7、扩增产物量的检测 (二) 实验阶段1、反应体系的确定2、模板浓度的优化3、反应时间的优化4、扩增产物的检测5、以PCR的扩增作为对照三、 具体实验方案(一) 引物的设计LAMP引物设计的在线网站(http:/primerexplorer.jp/e/)，只要导入靶基因就能自动生成成组引物。1、 LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3 端的F3c、F2c和Flc区以及5 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。2、引物设计要点设计合适的引物是进行LAMP反应的关键，通过考虑碱基组成，GC含量，二级结构的形成，Tm值等。在进行LAMEP引物设计的时候有以下几个关键点需要考虑： 引物之间的距离 F2区段的5端到B2区段的5端(LAMP反应扩增的区域)之间的距离建议是120180bp。 F3区段的3端到F2区段的5端之间的距离是020bp(同理B2和B3之间的距离是020bp)。 F2区段的5端到F1区段的5f端(形成环的部分)之间的距离是4060bp。 引物的Tm值 一般情况下，根据引物与模板结合的先后顺序，其Tm值表现为： F1c、B1cF2、B2，这样链置换后形成的单链会易于结合成loop F2、B2F3、B3，确保内引物会先于外引物结合到模板上进行扩增3、引物设计结果LNMP学习 HP-F： CGCGAGGTACCGAGCTCGTAAAACGACGGCCAGTGAATTC F： M13-47. HP-R： GGCCTGCATGCAAGCTTGCAGCTATGACCATGATTACGC R： M13-48. (二) 引入合适的酶切位点方便扩增产物酶切后长度单一化。(三) 聚合酶和反应温度的选择用Bst聚合酶在60、63和65三个梯度温度下进行扩增，用Phi29聚合酶在37进行扩增，在其他因素相同的条件下，比较两种酶的扩增效率，选取最优的聚合酶以及该聚合酶最佳的反应温度。(四) 最佳反应时间的选择同样的条件下设置几个平行反应，分别在15min、30min、45min、60min、75min后通过琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增结果。.(五) 延伸反应1、反应体系(1) 反应体系的配制（25ul） FIP 0.8uM BIP 0.8uM F3 0.1uM B3 0.1uM Each dNTP 400uMbetain 1MTris-HCL 20mmKCL 10mm(NH4)2SO4 10mmMgSO4 4mmTriton X-100 0.1%Target DNA(2) 变性退火将上述反应体系（除酶外）在95加热5min后，冷却，再加入8U Phi29 DNA 聚合酶(3) 等温延伸参63保温延伸一定时间(4) 终止反应在高于80的温度下加温2min，终止反应。 (六) PCR 表1 PCR Mix配制 加入量10 PCR buffer5uld NTP 1 ulM13-47（10um）1ulM13-48（10um）1ul模板 230bp 0.5ulTaq Polymerase0.5ulH2O111ulTotal50ul (七) 通过观察白色沉淀的量来检测LAMP扩增产物LAMP反应阶段，随着反应的进行，dNTP会释放出焦磷酸根离子，焦磷酸根离子遇到Mg2+会生成焦磷酸镁白色沉淀，一般情况下，生成的白色沉淀与反应液中双链DNA的量是成正比的，因此可以通过浊度仪检测白色沉淀的量来定性反应的进行程度。只有当反应体系中dNTP的量达到0.5M时才有可能肉眼观测到沉淀。另外，PCR过程中不断的95热变性也阻碍了焦磷酸镁这一白色沉淀的生成。(八) 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，SYBR Green染色扩增结束后，其最后的产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显示不同大小区带的阶梯式图谱。四、LAMP优点1、快速、高效因为不需要预先的双链DNA的热变性，避免了温度循环而造成的时间损失。核酸扩增在1h内均可完成，添加环状引物后时间还可以节省1/2左右，在20-30min内就可检测到扩增产物，1h内可扩增出109个靶序列拷贝，且产物可以达到0.5mg/ml.2、高灵敏度对某些病毒的扩增，模板可达几个拷贝数即可，比PCR高出几个数量级。3、高特异性因为是针对靶序列的6个区域设计的4种特异性引物，6个区域中任何一处与引物不匹配均不能进行核酸扩增。4、产物检测方便LAMP在合成DNA的同时会产生大量的焦磷酸跟离子，它们能与镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，因此可以根据反应体系中是否生成白色沉淀来判断反应的进行情况。5、操作简单LAMP反应只需要一个简单的恒温器，水浴锅、金属浴均可完成此操作，并不需要多么昂贵的仪器，可操作性强，易于推广。6、RT-LAMP当模板是RNA时，只需在反应体系中加入反转