苦丁茶多酚的提取及抗氧化活性研究.doc

苦丁茶多酚的提取及抗氧化活性研究刘佳，焦士蓉*，唐远谋，唐鹏程，冯慧（西华大学生物工程学院，成都，610039）摘要：对苦丁茶中多酚的提取及抗氧化活性进行研究。通过单因素和响应面实验可知，在乙醇浓度50%、固液比为1：24、提取时间为62s、微波功率为291W时可获得最高的提取率，为115.40mg/g。苦丁茶多酚对DPPH自由基、OH由基、O2自由基的半清除浓度以及对脂质过氧化的半抑制浓度分别为29.24mg/L、34.14mg/L、872.3mg/L、11.48mg/L。关键词：苦丁茶；多酚；提取；响应面分析法；抗氧化Study on the extraction of polyphenols from Kuding Tea and antioxidant activitiesLIU Jia, JIAO Shi-rong*,TANG Yuan-mou,TANG Peng-cheng,FENG Hui(School of Bioengineering of Xihua University,chengdu,610039)Abstract: Kuding Tea polyphenols extraction optimization and its antioxidant activities were studied in this paper. The best processing parameters for extraction were attained by single factors and RSM, when the ethanol concentration was 52% , solid-liquid ratio was 1:24, at 291W for 62s the yield of polyphenols was 114.82mg/g.The effective concentration for scarenging 50% DPPH free radical,hydroxyl radical,O2-radical were 29.24mg/l,34.14mg/l and 872.3mg/l,respectively. The effective concentration of inhibitory 50% lipid peroxidation was 11.48mg /l.Keywords: Kuding Tea; polyphenols; extraction; response surface analysis; antioxidan.“苦丁茶”是我国一大类代茶植物或代茶产品的统称。冬青属苦丁茶主要产于我国南部及西南部地区，是民间传统的药用植物。据文献报道，苦丁茶有防治心脑血管系统疾病、降低血压、降脂、抗氧化等药理保健作用1，其粗提物均有不同程度的抑菌作用2。由苦丁茶冬青叶片制成的苦丁茶是民间常用中草药，是传统中成药“甘和茶”的主要原料之一3，其所含的各种成分的药理作用及保健功能日益引起人们的关注4。 本文采用响应面法，以苦丁茶多酚含量作为响应值，对苦丁茶多酚的提取进行了探讨，旨在得到最优的提取工艺，并通过几个方面研究苦丁茶多酚的抗氧化性能，为苦丁茶保健成分的开发提供了依据。1 材料与方法1.1 材料与仪器作者简介刘佳(1987-)，女，四川广元人，硕士研究生，研究方向：食品营养与安全，Email：*通讯作者：焦士蓉(1968-)，女，博士，副教授，安徽安庆人，硕士生导师，研究方向：食品生物技术，Email： 原料：苦丁茶粉碎过80目筛；福林-酚试剂（北京奥博星生物技术有限责任公司）；DPPH自由基（Sigma公司）；2-硫代巴比妥酸（上海科丰化学试剂有限公司）；其他常见试剂均为分析纯，成都科龙化工试剂厂。仪器： TB-214型电子天平 (美国丹佛仪器设备厂)；HH-S型数显恒温水浴锅 (金坛市金城国胜实验仪器厂)；UV-2600型紫外可见分光光度计 (上海尤尼柯仪器有限公司)；MP17C-KE美的家用微波炉 (佛山市顺德区北滘镇三洪奇工业区)。1.2 试验方法1.2.1 多酚含量测定 采用福林-酚比色法5，以没食子酸为标准品，标准曲线y=0.0081x0.0286，R2=0.9999，计算公式为p=(cvn) /(w103)。1.2.2 抗氧化活性的测定 对DPPH自由基的清除按照文献6的方法并做适当修正：称取2,2-二苯代苦味酰基（2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）标准品20mg，无水乙醇定容至500mL，得浓度为0.04mg/mL溶液。取此溶液3mL，加入样品液1 mL，室温反应30min，517nm处测定吸光度值，空白组以1 mL无水乙醇代替样品液，并按下式计算清除率：DPPH清除率（%）=（1-A试样/A空白）100% 对OH自由基的清除按照金鸣7等人的比色法，以下式计算清除率H(%)： 对O2自由基的清除参照文献8的实验方法，清除率按照下式计算S(%)： 对脂质过氧化的抑制参考文献9的方法进行对脂质过氧化抑制率的测定，抑制率I（%）计算公式为：2 结果与分析2.1 提取溶剂的筛选称取苦丁茶粉样品2克，采用水及分析纯的乙醇、丙酮、乙酸乙酯溶液作为溶剂，在提取时间为80s、固液比为1:20、微波功率为291W的条件下进行实验，结果如图1：图1 溶剂对苦丁茶多酚提取的影响Fig.1:The effect of solvents on the extraction of polyphenols from Kuding Tea由图1可知：提取溶剂为丙酮时，苦丁茶多酚提取率最高，乙醇次之；由于丙酮的毒性以及溶剂价格较高的因素，选取乙醇作为提取溶剂。2.2 单因素实验结果与分析2.2.1 乙醇浓度对苦丁茶多酚提取的影响按照2.1的提取方法，改变乙醇浓度进行实验，结果如图2： 图2 乙醇浓度对苦丁茶多酚提取的影响Fig.2:The effect of ethanol concentration on the extraction of polyphenols from Kuding Tea由图2可知，当乙醇浓度为50%时，苦丁茶多酚的提取率最高，故乙醇浓度选取50%。2.2.2 料液比对苦丁茶多酚提取的影响乙醇浓度为50%，其他条件同2.2.1，改变料液比，结果如图3：图3 固液比对苦丁茶多酚提取的影响Fig.3:The effect of solid-liquid ratio on the extraction of polyphenols from Kuding Tea由图3可知：当料液比为1:20时苦丁茶多酚提取率最高，故选取料液比为1:20。 2.2.3 提取时间对苦丁茶多酚提取的影响料液比为1:20，其他条件同2.2.2，改变提取时间，结果如图4：图4 提取时间对苦丁茶多酚提取的影响Fig. 4:The effect of microwave time on the extraction of polyphenols from Kuding Tea由图4可知，当提取时间为60s时，苦丁茶多酚提取量最大，选取提取时间60s。2.2.4 微波功率对苦丁茶多酚提取的影响选取提取时间为60s，其他条件同2.2.3，改变微波功率，结果如图5：图5 微波功率对苦丁茶多酚提取的影响Fig.5:The effect of microwave power on the extraction of polyphenols from Kuding Tea由图5可知，微波功率为291W时，苦丁茶多酚提取最高，故选取提取功率为291W。2.3 响应曲面法结果与分析选取乙醇浓度、料液比、提取时间3个因素做Box-Behnken设计，并且以苦丁茶多酚含量作为响应值，设计及结果见下表。表1 Box-Behnken设计实验因素水平及编码Table 1 Box-Behnken design experiments factor level and codes变量代码编码水平未编码编码10+1乙醇浓度/(%)X1A405060固液比/(W:V)X2B152025提取时间/(s)X3C506070注：A=(X1-50)/10；B=(X2-20)/5；C=(X3-60)/10表2 Box-Behnken设计Table 2 Box-Behnken design实验编号ABC含量(mg/g)111095.00211099.36311098.554110109.155101104.366101104.85710195.658101100.209011110.4510011110.041101196.2412011114.6313000112.0214000113.8315000113.80利用Design Expert软件对上述结果进行分析，得到多酚含量（Y）对乙醇浓度（A）、固液比（B）、提取时间（C）的二次多项回归方程：Y=113.222.50A3.92B2.87C1.56AB1.02AC4.70BC9.64A23.06B22.31C2实验所选用模型P值为0.0019，极显著（P0.05），决定系数R2 =0.9741，说明响应值的变化有97.41%来源于所选变量，该方程的拟合情况好。响应面图形是响应值对各试验因子X1、X2、X3 所构成的三维空间的曲面图，从响应面分析图上形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用。当特征值均为正值时，响应面分析图为山谷形曲面，有极小值存在；当特征值为负值时，为山丘曲面，有极大值存在；当特征值有正有负时，为马鞍形曲面，无极值存在，下面是根据回归方程作出不同因子的响应面分析图：图6浓度与料液比对含量的响应面图Fig.6 Ethanol concentration and solid-liquid ratio on the content rate response surface maps图7料液比与时间对含量的响应面图Fig.7 Solid-liquid ratio and time on the content rate response surface maps图8浓度与时间对含量的响应面图Fig.8 Ethanol concentration and time on the content rate response surface maps等高线为响应面图在底面的投影，由上三图知，其等高线均为椭圆，说明三者彼此间交互效果显著。由图6可知乙醇浓度对苦丁茶多酚提取率影响比较大，表现为曲线较陡，料液比对苦丁茶多酚提取影响不是很大，表现为曲线较为平缓。当乙醇浓度在0水平，即50%时，多酚提取含量最大，说明过高过或过低的乙醇浓度均不适合苦丁茶多酚的提取。由图7可知，料液比对苦丁茶多酚提取率影响比较小，而提取时间对苦丁茶多酚提取影响较大，且较短的时间更有利于提取。图8进一步说明乙醇浓度对苦丁茶多酚提取率影响比较大，曲线较陡。2.4 验证试验通过实验辅助软件Design Expert优化提取条件得到理论的五组多酚含量在114.80mg/g，表明最佳实验参数的范围为：乙醇浓度在51%53%；固液比在1:231:25；提取时间在60s64s。经以上分析，再综合实验的好操作性，选取乙醇浓度为50%、料液比为1:24、提取时间为62s，进行验证试验。根据回归方程，计算其预测值为114.4832mg/g。进行3词平行实验，得到平均结果为115.40mg/g，相对误差为0.8%，证明响应面优化苦丁茶多酚的提取工艺是可行的。2.5 抗氧化活性的测定2.5.1 对DPPH自由基的清除结果及分析用不同浓度的多酚提取液，进行DPPH自由基清除实验，结果如图9： 图9苦丁茶多酚对DPPH自由基清除作用Fig.9 Different concentrations of polyphenol extracts on DPPH radical scavenging effect由回归方程得，苦丁茶多酚对DPPH自由基的半清除浓度为EC50=29.24mg/L。2.5.2 对OH自由基的清除结果及分析不同浓度的多酚提取液，进行OH自由基清除实验，实验结果如图10：图10苦丁茶多酚对OH自由基的清除作用Fig.10 Different concentrations of polyphenol extracts on OH radical scavenging effect由回归方程得，苦丁茶多酚对OH自由基的半清除浓度为HC50=34.14mg/L。2.5.3 对O2自由基的清除结果及分析不同浓度的多酚提取液，进行超氧阴离子自由基的清除实验，实验结果如图11：图11苦丁茶多酚对O2自由基的清除作用Fig.11Different concentrations of polyphenol extracts on O2 radical scavenging effect由回归方程计算得，苦丁茶多酚对O2自由基的半清除浓度为SC50=872.3mg/L。2.5.4对脂质过氧化的抑制结果及分析不同浓度的多酚提取液，进行脂质过氧化抑制实验，实验结果如图12：图12 苦丁茶多酚对脂质过氧化的抑制作用Fig.12 Different concentrations of polyphenol extracts on lipid peroxidation inhibiting effect根据回归方程计算得，苦丁茶多酚对脂质过氧化的半抑制浓度为：IC50=11.48mg/L。3 结论3.1通过单因子试验，确定了苦丁茶多酚提取的最佳试验条件：溶剂为乙醇、乙醇浓度为50%、固液比为1:20、提取时间为60s、微波功率为291W。3.2通过Box-Behnken响应曲面法试验，确定了苦丁茶多酚提取的最佳试验条件：乙醇浓度为62%、固液比为1：24、提取时间为62s。以该优化条件在微波功率291W时提取苦丁茶多酚含量达到115.40mg/g。3.3进行抗氧化实验可知其对DPPH自由基、OH自由基、O2自由基的清除能力以及对脂质过氧化的抑制能力都随苦丁茶多酚浓度呈线性增加，其对DPPH自由基、对OH自由基、对O2自由基的半清除浓度分别为： 29.24mg/L、 34.14mg/L、 872.3mg/L，对脂质过氧化的半抑制浓度为11.48mg/L。参考文献：1 刘宗岸.冬青属苦丁茶的保健功效及利J.热带农业科技,2009,32(2):26-28.2 Lv Ping,Huang Qiang. Study on In vitro Bacteriostasis of the Different Extract from Ilex Kudingcha CJTsengJ.Agricultural Science & Technlogy,2009,10(6):125-127.3 王新,