6. 核糖体与核酶07836.doc

6核糖体与核酶6.1 核糖体的形态结构6.1.1 核糖体的类型和化学组成6.1.2 核糖体蛋白质与rRNA6.1.3 细菌核糖体的结构模型6.2 核糖体的生物发生6.2.1 核糖体rRNA基因的转录与加工6.2.2 核糖体的装配6.3 核糖体的功能蛋白质的合成6.3.1 核糖体的功能位点6.3.2 蛋白质合成的基本过程6.3.3 多聚核糖体6.3.4 蛋白质合成抑制剂6.3.5 蛋白质的寿命与降解6.4 反义RNA与核酶6.4.1 小分子RNA与反义RNA6.4.2 核酶6.4.3 内含子的切除: 核酶的作用机理6.4.4 RNA编辑学习指导录像6核糖体与核酶 核糖体(ribosome)，是细胞内一种核糖核蛋白颗粒(ribonucleoprotein particle), 其惟一功能是按照mRNA的指令将氨基酸合成蛋白质多肽链,所以核糖体是细胞内蛋白质合成的分子机器。核糖体最早是Albert Claude于20世纪30年代后期发现的, 其后又证明了其蛋白质合成功能。随着分子生物学的发展， 核糖体概念的涵意有了进一步的发展。细胞内除了从事蛋白质合成的核糖体外， 还有许多其它功能的核糖核蛋白体颗粒， 通常是一些小分子的RNA同蛋白质组成的颗粒， 它们参与RNA的加工、RNA的编辑、基因表达的调控等。发现核糖体及核糖体功能鉴定的两个关键技术是什么?6.1 核糖体的形态结构核糖体是细胞内数量最多的细胞器，原核细胞和真核细胞都有核糖体，功能也相同，但是结构组成却有很大差别。6.1.1 核糖体的类型和化学组成 核糖体的类型 按存在的部位:有三种类型核糖体，细胞质核糖体、线粒体核糖体、叶绿体核糖体。 按存在的生物类型: 分为两种类型，即真核生物核糖体和原核生物核糖体。原核细胞的核糖体较小， 沉降系数为70S，相对分子质量为2.5x103 kDa，由50S和30S两个亚基组成(图6-1)；而真核细胞的核糖体体积较大， 沉降系数是80S，相对分子质量为3.94.5x103 kDa， 由60S和40S两个亚基组成。图6-1 从两个不同角度观察的E.coli 核糖体的三维结构 Mg2+ 的浓度对于大小亚基的聚合和解离有很大的影响， 体外实验表明:70S核糖体在Mg2+的浓度小于1mmol/L的溶液中易解离; 当Mg2+浓度大于10mmol/L， 两个核糖体通常形成100S的二聚体(图6-2)。图6-2 通过区带离心鉴定核糖体的亚基在低浓度的Mg2+时，完整的核糖体将分成大小两个亚基。 在组成上，叶绿体中的核糖体与原核生物核糖体相同，但线粒体中核糖体的大小变化较大(表6-1)。表6-1 不同类型核糖体的大小比较来源完整核糖体核糖体亚基核糖体RNAs细胞质80S60S(大亚基)28S，5.8S，5S(真核生物)40S(小亚基)18S，细胞质70S50S(大亚基)23S，5S(原核生物)30S(小亚基)16S线粒体55-60S45S(大亚基)16S(哺乳动物)35S(小亚基)12S线粒体75S53S(大亚基)21S(酵母)35S(小亚基)14S线粒体78S60S(大亚基)26S，5S(高等植物)45S(小亚基)18S叶绿体70S50S(大亚基)23S，5S30S(小亚基)16S 核糖体的化学组成核糖体的大小两个亚基都是由核糖体RNAs(rRNAs)和核糖体蛋白(ribosomal proteins)组成的， 原核生物和真核生物细胞质核糖体的大小亚基在蛋白质和RNA的组成上都有较大的差别(图6-3)图6-3 典型的原核细胞和真核细胞质核糖体的化学组成6.1.2 核糖体蛋白质与rRNA由于核糖体有着十分重要的生物学功能，所以有关其结构和各种结构域的功能，一直是研究的重点。为了建立一个完整的核糖体分子结构模型，必须了解构成核糖体的每一个蛋白质和rRNA分子在核糖体中的位置。 核糖体蛋白通过电泳和层析等技术，已经鉴定了E.coli核糖体小亚基的21种蛋白质和大亚基的34种蛋白质。小亚基的蛋白分别命名为S1S21，大亚基的核糖体蛋白命名为L1L33。核糖体中的蛋白质除了一种具有四个拷贝外，其余都是一个拷贝。图6-4是E.coli小亚基21种蛋白质的排列。图6-4 E.coli小亚基21种蛋白质的排列 核糖体rRNAHarry Holler测定了E.coli 16S rRNA序列，一共有1542个核苷酸。通过计算机分析，发现不同生物来源的16S rRNA的序列组成具有进化上的保守性。推测16S rRNA结构有四个结构域， 每个结构域都有46%的碱基配对，形成螺旋的柄状结构(图6-5)。每一个柄状结构都很短，不到8 bp，且并不都是完全配对的。16S rRNA的电子显微照片的形态与30S核糖体亚基相似，因此认为30S核糖体亚基的形态主要是由16S rRNA决定的。图6-5 E.coli中16S rRNA分子折叠的二级结构折叠主要是由序列中互补碱基配对引起的。 6.1.3 细菌核糖体的结构模型为了揭示核糖体的空间结构以及核糖体蛋白质和rRNA相互间的关系，分别用物理、化学以及显微技术进行了大量的研究工作，在这些研究工作的基础上提出了细菌核糖体的结构模型(图6-6)。模型中蛋白质的定位是根据不同来源的资料分析综合后确定的，如S4、S5、S8和S12等四个蛋白定位在核糖体的小亚基上，并且是背向大亚基，就是根据四种不同方法获得的资料，比较分析后确定的。图6-6 E.coli 核糖体结构模型图中分别显示了小亚基、大亚基中一些核糖体蛋白质的位置，以及蛋白质合成过程中mRNA在核糖体中的位置。 在该模型中确定了一些重要的功能区和RNA的结合位点(图6-7)。 图6-7 核糖体结构及功能位点6.2 核糖体的生物发生(biogenesis)核糖体的合成和装配过程相当复杂。真核细胞和原核细胞的核糖体合成和装配过程各不相同。核糖体的生物发生包括蛋白质和rRNA的合成、核糖体亚基的组装等。6.2.1 核糖体rRNA基因的转录与加工核糖体的组成成分是蛋白质和rRNA，所以编码核糖体的基因分为两类，一类是蛋白质基因，另一类是rRNA基因。在生活细胞中，特别是在活跃进行蛋白质合成的细胞中，需要大量的核糖体，这就意味着需要合成大量的rRNA和核糖体蛋白质。 编码rRNA基因的过量扩增细胞为了满足大量需求的rRNA,通过两种方式扩大rRNA基因的拷贝数： 在染色体上增加rRNA基因的拷贝数，如在细菌E.coli的基因组中有七套rRNA基因，而典型的真核生物细胞含有几百到几千个28S、18S和5.8S rRNA基因的拷贝，5S rRNA基因的拷贝数多达50000个。 通过基因扩增(gene amplification)。科学家用两栖类的卵细胞(卵母细胞)研究在发育过程中rRNA基因的扩增。发现两栖类卵母细胞在发育的早期，rRNA基因的数量扩增到1000多倍(图6-8)。图6-8 非洲爪蟾卵母细胞中rRNA的合成卵母细胞中含有几百个核仁，每个核仁都含有扩增的rRNA基因。 真核生物18S、5.8S、28S rRNA和5SrRNA基因编码rRNA基因的DNA称为rDNA。真核生物有四种rRNA基因, 其中18S、5.8S和28S rRNA基因是串联在一起的,每个基因被间隔区隔开, 5S rRNA基因则位于不同染色体上。说明人体单倍体染色体组中四种rRNA基因的组成、排列方式和拷贝数。 18S、5.8S、28S rRNA基因转录与加工 转录蛋白与45S的前体18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA基因首先转录成一个45S的前体rRNA(pre-rRNA)，大约是这3 个rRNA总长的2倍。能够转录这3个rRNA前体的DNA区域称为一个转录单位(transcription unit)，意指它们有一个共同的转录起点和转录终点。在转录单位中除了这三个rRNA基因外，还包括一些间隔区。 转录酶:真核生物中参与rRNA基因转录的酶是RNA聚合酶。 前体加工前体rRNA在核仁中被酶剪切成3个rRNA产物， 转录间隔区则被降解掉。根据3H标记的尿嘧啶和放线菌素D研究人的培养细胞前体rRNA的合成的结果推测了前体rRNA的加工过程(图6-9)。图6-9 45SrRNA的加工过程在rRNA聚合酶的作用下，将18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA转录成45S的前体，然后通过一系列的切割加工形成成熟的18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA。其中5.8S的rRNA通过互补碱基的氢键与28S rRNA结合在一起。 虽然所有真核生物的18S、5.8S和28S rRNA基因是相同的， 并且在染色体上组成同一个转录单位， 但是不同生物中的18S、5.8S和28S rRNA基因的转录起点和间隔区的长短并不完全相同(图6-10)。图6-10 rRNA转录单位图的上半部是正在转录的rDNA形成的刷状rRNA;下半部是一个转录单位的转录物,并将蛙的rRNA转录单位与小鼠的转录单位进行比较。从图中可见:基因间被可转录的间隔物隔开;转录单位之间有非转录区;不同生物的rDNA的转录起点可能不同;不同生物的rDNA各基因间的间隔序列长短不同。 由于不同生物的rDNA 转录起点不同、间隔区长短不同，所以 pre-rRNA的长度不都是45S，范围在34S45S之间(表6-2)。表6-2 不同种生物的前体rRNA生物pre-rRNA的沉降系数果蝇34S裂殖酵母37S烟草38S蛙40S鸡45S小鼠45S人45S 真核生物前体rRNA的修饰 前体rRNA有两个独特的特点:一是含有大量的甲基化的核苷,另一个就是具有很多假尿苷(pseudouridine)。在人的前体RNA加工过程中,有100多个甲基添加到前体分子的核糖上,并且有95%的尿嘧啶被转变成假尿苷。 前体rRNA的甲基化及其意义:前体rRNA分子中的某些碱基进行甲基化修饰，甲基化的主要部位在核糖第二位的羟基上，在甲基化的过程中需要snRNA的参与。甲基化可能对加工起引导作用。实验证明前体rRNA中被甲基化的部位在加工过程中并未被切除，而是一直保持到成熟的rRNA中。另外还发现，如果人为地阻断前体rRNA的甲基化，前体rRNA的成熟加工也被阻断，因此，推测前体rRNA的甲基化对rRNA的加工具有指导作用。另外，前体rRNA的修饰可能有利于rRNA的正确折叠，以及与别的分子正确的相互作用。 5S rRNA基因的转录与加工5S rRNA是核糖体大亚基的一个组份，原核生物和真核生物都有5S rRNA，而且结构相似。 5S rRNA基因: 真核生物的5S rRNA基因与其他三种rRNA基因不在同一条染色体上，它是由核仁以外的染色体基因转录的，然后运输到核仁内参与核糖体的装配。非洲爪蟾的5S rRNA基因的一个重复单位含有一个5SrRNA基因、一个不转录的假基因(101bp的5S rRNA基因的片段)，每个重复单位间被不转录的间隔序列隔开，间隔序列的长度变化不定，最长达400bp(图6-11)。图6-11 非洲爪蟾的5SrRNA基因的组织结构 5S rRNA基因转录酶: 5S rRNA基因是由RNA聚合酶转录的，原初转录物的5端与成熟的5S rRNA的5端完全相同。在某些生物中，3端通常含有多余的核苷酸，在加工时要被切除。所以，5S rRNA只需要进行简单的加工，或者根本不需要进行加工。 内部启动子RNA聚合酶转录5S rRNA基因时使用的是内部启动子，其他的两种酶使用的是上游启动子，实验也证明这种内部启动子的存在。如何证明RNA聚合酶进行5SrRNA基因转录时使用的是内部启动子? 原核生物rRNA基因及转录原核生物rRNA基因也是多拷贝的，并且也要被转录成一个前体，然后再经加工成成熟的rRNA。 原核生物和真核生物的rRNA基因在组织结构的差异 基因的重复次数: 真核生物的rRNA基因重复的次数相当高，而原核生物的rRNA基因的重复次数却很少，例如E.coli，只重复了7次。 真核生物编码5S rRNA的基因位于不同的染色体上，而细菌的5S rRNA基因与另外两种rRNA基因组成一个转录单位，它们在染色体上的排列顺序是16S-23S-5S。 转录: 实验证明原核生物的16S-23S-5S三种rRNA位于同一条转录的rRNA分子中, 转录后由核酸酶(RNase)切成三个分子。如何证明原核生物的16S-23S-5S三种rRNA位于同一条转录的rRNA分子中?细菌中的rRNA转录单位除了转录三种rRNA外，同时也会产生几种tRNA分子。在16S和23S rRNA 间可产生12个tRNA,在5S rRNA基因的下游也会产生12个tRNA。同真核生物一样，细菌的rRNA也有甲基化，但比真核生物rRNA甲基化程度低。细菌的rRNA加工过程示于图6-12。图6-12 E.coli前体rRNA的转录与加工6.2.2 核糖体的装配核糖体是自我装配的细胞器，当蛋白质和rRNA合成加工成熟之后就要开始装配核糖体的大小两个亚基，真核生物核糖体亚基的装配地点在细胞核的核仁部位，原核生物核糖体亚基的装配则在细胞质中。 核糖体亚基的自我装配 自组装(self-assembly): 1968年， Masayasu Nomura把拆开的大肠杆菌核糖体的30S小亚基的21种蛋白质与16S rRNA在体外混合后重新装配成30S小亚基， 然后把重建的小亚基同50S大亚基以及其他辅助因子混合后， 进行蛋白质合成实验，发现重建的核糖体具有生物活性，能催化氨基酸掺入到蛋白质多肽链中。这一实验表明，核糖体是一种自组装(self-assembly)的结构，即没有样板或亲体结构所组成的结构。但是在组装过程中，某些蛋白质必须首先结合到rRNA上，其他蛋白才能组装上去，即组装过程有先后层次(图6-13)。图6-13 E.coli 小亚基的装配图粗箭头表示结合力强，细箭头表示力弱。如S4与16S rRNA之间是粗箭头，表示S4可直接与16S rRNA结合而不需要其他蛋白的存在。而S7与16S rRNA的结合力很弱，并且需要S4、S8、S9、S19、S20蛋白的存在。 30S亚基蛋白质分类: 在核糖体重装配过程中，可以通过减去某一种蛋白质来验证该蛋白质在亚基装配及亚基中的作用。据此，可将30S亚基上的蛋白质分为三类:开始装配所必需的蛋白质，它们先和rRNA特定区段结合，形成核糖体亚基的核心;结合后可为后一批蛋白提供结合位点；非30S亚基形成所必需，但却是显示其活性所必需的。 原核生物核糖体重组(ribosome recombination)实验所谓核糖体重组是指将不同来源的核糖体大小亚基、或不同亚基的rRNA或蛋白质重新组合， 形成杂合的核糖体后研究其功能的实验方法。有人用核糖体重组实验得到一些重要的结论, 请说明主要内容 真核生物核糖体在核仁中装配 主要过程:图6-14 是关于人细胞中核糖体装配过程图6-14 人细胞中核糖体装配的主要过程20世纪60年代初期Robert Perry发现核糖体的合成是在核仁中进行的, 请问是如何发现的?6.3 核糖体的功能-蛋白质的合成核糖体的功能是进行蛋白质的合成。在核糖体上合成的是蛋白质的一级结构，即多肽链。合成是从多肽链的N端开始，到C末端结束。对于mRNA来说，合成的方向则是53。蛋白质的合成涉及核糖体的一些功能位点和RNA的作用。 6.3.1 核糖体的功能位点原核生物核糖体中有四种与RNA分子结合的位点，其中一个是与mRNA结合的位点，另三个是与tRNA结合的位点(图6-15)。图6-15 原核生物核糖体中与RNA结合的位点 A位点(A site) P位点(P site) E 位点(exit site ，E site) mRNA结合位点 真核生物的mRNA同核糖体的结合主要靠5端的帽子结构， 有时也通过IRES同核糖体结合(图6-16);图6-16 真核生物蛋白质合成的起始， IRES是内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site)。原核生物mRNA中与核糖体16S rRNA结合的序列称为SD序列(SD sequence) (图6-17)。图6-17 典型的细菌核糖体与mRNA的结合位点mRNA中的SD序列与核糖体16S rRNA3端互补。在SD序列的下游510个碱基处是起始密码AUG或GUG。6.3.2 蛋白质合成的基本过程蛋白质合成，或称mRNA翻译是细胞中最复杂的合成活动。蛋白质的合成需要携带氨基酸的各种tRNA、核糖体、mRNA、不同功能的蛋白质、阳离子、GTP等的参与。蛋白质合成过程之所以复杂，是因为构成蛋白质的20种氨基酸要按照密码精确地掺入到多肽中，不能有丝毫的差错。蛋白质的合成，是三种不同类型的RNA通力合作的结果(图6-18)。图6-18 RNA在蛋白质合成中的三种作用 在核糖体上合成多肽链，分为三个完全不同的过程: 链的起始、链的延伸、链的终止(图6-19)。图6-19 蛋白质合成的三个主要过程 蛋白质合成的起始(initiation)蛋白质合成的起始涉及到mRNA、起始tRNA和核糖体小亚基之间的相互作用，最后装配成完整的核糖体，起始过程分三步完成(图6-20)。图6-20 原核生物蛋白质合成的起始起始过程涉及多步反应，在原核生物中需要三个起始因子，在真核生物中涉及多个起始因子。原核生物蛋白质合成起始复合物形成包括哪些过程?需要哪些因子参与? 多肽链的延伸(elongation)一旦起始复合物形成，蛋白质的合成随即开始，此过程称为蛋白质合成的延伸。延伸涉及四个重复的步骤氨酰tRNA进入核糖体的A位点；肽键形成；转位;脱氨酰tRNA释放。上述四步的循环，使肽链不断延长。在整个过程中，需要GTP和一些延长因子的参与(图6-21)。图6-21 蛋白质合成的延伸请详细说明多肽链延伸的过程在肽链延伸过程中tRNA的转位是如何进行的? 终止(termination)蛋白质合成的终止是指核糖体沿着mRNA移动，如果进入A位的是终止密码子，由于没有与之匹配的反密码子，而终止蛋白质的合成。一共有三种终止密码子:UAA、UAG、UGA，其中任何一种进入A位都会终止蛋白质的合成，并导致多肽链从核糖体释放出来(图6-22)。图6-22 蛋白质合成的终止原核细胞使用几种不同的释放因子与终止密码子作用，而真核细胞中所有的终止密码子都是与相同的释放因子作用。6.3.3 多聚核糖体(polyribosomes)在蛋白质合成过程中，同一条mRNA分子能够同多个核糖体结合，同时合成若干条蛋白质多肽链，结合在同一条mRNA上的核糖体就称为多聚核糖体(polysome 或polyribosomes，图6-23)。 图6-23 电子显微镜观察的多聚核糖体图中所示是蚕的丝心蛋白mRNA3端多聚核糖体，箭头所示是丝心蛋白多肽。 多聚核糖体的发现20世纪60年代，有几个实验室先后发现了多聚核糖体。如Richs实验室是用未成熟的红细胞研究蛋白质合成时发现了多聚核糖体。他们将未成熟的红细胞与放射性物质进行短暂培养，以标记新合成的蛋白质。然后温和地破碎细胞，离心除去细胞核和线粒体，收集上清液，在上清液中含有核糖体。然后通过移动区带离心，发现除了80S的核糖体之外，还有170S的核糖体，而放射性的标记物主要存在于170S的核糖体上，因此推断在蛋白质合成时，核糖体可能是成串存在的。电子显微镜观察证实：80S的核糖体是单个存在的，而170S的核糖体是由46个核糖体组成的多聚核糖体。 多聚核糖体的形成 在mRNA的起始密码子部位，核糖体亚基装配成完整的起始复合物，然后向mRNA的3端移动，直到到达终止密码子处。当第一个核糖体离开起始密码子后，空出的起始密码子的位置足够与另一个核糖体结合时，第二个核糖体的小亚基就会结合上来，并装配成完整的起始复合物，开始蛋白质的合成。同样，第三个核糖体、第四个核糖体、依次结合到mRNA上(图6-24)。根据电子显微照片推算，多聚核糖体中，每个核糖体间相隔约80个核苷酸。图6-24 多聚核糖体的形成与蛋白质合成多聚核糖体形成的意义何在?6.3.4 蛋白质合成抑制剂不同的蛋白质合成抑制剂具有不同的作用方式，是研究蛋白质合成机制的有用工具。 抗生素抗生素(antibiotics)是主要的蛋白质合成抑制剂，如氯霉素、链霉素等。不同抗生素的作用机制不同。如链霉素主要是抑制起始tRNA和非起始tRNA与核糖体的结合,导致肽链合成的提前终止。有些抗生素抑制50S大亚基肽酰转移酶的活性,如氯霉素。表6-3是某些常用抗生素的作用。表6-3 某些常用的蛋白质合成抑制剂名称作用对象阻断过程影响效果作用的细胞类型氯霉素50S延伸肽键形成原核生物大肠杆菌素E330S起始、延伸与mRNA结合原核生物与氨酰tRNA结合 放线菌酮60S起始，延伸结合起始tRNA转位 (tRNA从P位释放)真核生物白喉毒素eEF-2 延伸转位 真核生物红霉素50S 起始起始复合物形成 原核生物梭链孢酸EF-G/ eFE-2延伸转位原核/真核生物春日霉素 30S 起始起始tRNA的结合原核生物嘌呤霉素 50S/60S 延伸肽键形成 (触发链释放)原核/真核生物壮观霉素30S 延伸转位原核生物链霉素30S 起始，延伸起始tRNA结合氨酰tRNA结合 (诱发错读)原核生物 四环素30S 延伸，终止 氨酰tRNA的结合 RF-1和RF-2的结合原核生物 紫霉素 50S/30S 阻断P位点转位原核生物图6-25 是一些几种抑制蛋白质合成的抗生素的结构。图6-25 几种常见的抑制蛋白质合成的抗生素 嘌呤霉素 结构 嘌呤霉素(puromycin)是一种蛋白质合成抑制剂,它具有与tRNA分子末端类似的结构(图6-26), 能够同氨基酸结合，代替氨酰化的tRNA同核糖体的A位点结合，并掺入到生长的肽链中。图6-26 嘌呤霉素与苯丙氨酰tRNA3末端结构的比较 对核糖体功能位点的研究 通过嘌呤霉素对蛋白质合成的抑制实验发现核糖体的A位点和P位点是两个独立的位点。实验分两组进行，在第一组实验中，将P位点结合有起始tRNA的核糖体与嘌呤霉素一起温育，发现嘌呤霉素与核糖体结合，并且能够同起始tRNA相互作用。在第二组实验中，将P位点结合有起始tRNA的核糖体先与氨酰-tRNA一起温育，使之形成肽键后再加入嘌呤霉素，此时加入的嘌呤霉素既不能同核糖体结合也不能与二肽酰tRNA相互作用。但是在反应体系中加入GTP和延长因子EF-G后，嘌呤霉素则又能与核糖体结合(图6-27)。图6-27 用嘌呤霉素证明核糖体的A、P是两个独立存在的位点根据这两组实验结果如何判断核糖体中的A、P是两个分开的独立位点?6.3.5 蛋白质的寿命与降解蛋白质合成是细胞中最重要的合成事件。但是，细胞内蛋白质的种类和数量的控制不仅和蛋白质合成的速度有关，而且与蛋白质的寿命相关。 蛋白质的寿命信号N-端规则(N-end rule): 每一种蛋白质都有寿命特征， 称为半衰期(half-life)。研究发现多肽链N-端特异的氨基酸与半衰期相关，称为N-端规则。表6-4总结了酵母中的N-端规则。 表6-4 裂殖酵母中N-端氨基酸对蛋白质半衰期的影响末端氨基酸残基半衰期末端氨基端残基半衰期Arg2 minIle30 min Lys3 minGlu30 min Phe3 minPro5 hr Leu3 minCys30 hr Trp3 minAla30 hr His3 minSer30 hr Asp3 min Thr30 hr Asn3 minGly30 hrTyr10 minVal30 hr Gln10 minMet30 hr 蛋白酶体对蛋白质的降解 蛋白酶体(proteasomes)蛋白酶体既存在于细胞核中,又存在于胞质溶胶中, 是溶酶体外的蛋白水解体系。蛋白酶体对蛋白质的降解通过泛素(ubiquitin)介导,故称为泛素降解途径。蛋白酶体对蛋白质的降解作用分为两个过程:一是对被降解的蛋白质进行标记,由泛素完成;二是蛋白酶解作用,由蛋白酶体催化(图 6-28)。图6-28 蛋白酶体对蛋白质的降解作用被降解的蛋白质与多个泛素分子共价结合，从而被标记;蛋白质-泛素共价结合的复合物与蛋白酶体顶部的帽子结合; 泛素被切除，未折叠的蛋白质被送入蛋白酶体的腔;-:蛋白质在蛋白酶体中被降解。6.4 反义RNA与核酶(ribozyme)在研究真核生物核糖体rRNA加工时发现了某些rRNA具有酶的功能，能够自我剪接，同时还发现一些小分子的反义RNA参与核糖体RNA的修饰。另外还发现50S核糖体中的23S rRNA具有肽酰转移酶的功能。将具有酶功能的RNA称为核酶。 6.4.1 小分子RNA与反义RNA真核生物中， 除了mRNA，rRNA和tRNA外， 细胞核和细胞质中含有许多其它类型的小分子RNA(small RNA)， 虽然它们的相对分子质量很小， 但却有非常重要的作用。 小分子RNA的类型主要有两种类型的小分子RNA:一类是snRNA(small nuclear RNA),存在于细胞核中；另一类是scRNA(small cytoplasmic RNA)，存在于细胞质中。由于snRNA富含尿嘧啶核苷，分类时把它分为U1、U2、等，常见的snRNA的类型和功能列于表6-5。表6-5 某些snRNA的特性RNA功能丰度(拷贝数/细胞)RNA聚合酶存在于核质中U1前体mRNA的剪接1106U2同上5105U4同上2105U5同上2105 U6同上4105U7组蛋白前体mRNA剪接5103U11 功能未知1104U12功能未知51037SK功能未知21058-2前体tRNA的加工(RNase)1105存在于核仁U3前体rRNA的加工2105(植物中则为)U8功能未知4104 U13功能未知11047-2功能未知1105 反义RNA与蛋白质合成的抑制 概念: 反义RNA(antisense RNA)是指与mRNA互补的RNA分子, 也包括与其它RNA互补的RNA分子。最早是在E.coli 的产肠杆菌素的Col E1质粒中发现反义RNA,许多实验证明在真核生物中也存在反义RNA。近几年来通过人工合成反义RNA的基因, 并将其导入细胞内转录成反义RNA, 即能抑制某特定基因的表达,阻断该基因的功能, 有助于了解该基因对细胞生长和分化的作用。 类型原核细胞中发现的反义RNA， 根据其作用方式分为三类: I类、类、类。根据原核细胞中反义RNA作用方式的不同分为三类， 请推测它们的作用方式有什么不同? sn RNA在pre-rRNA加工中的作用 sn RNPs(small nucleolar ribonucleoproteins) 细胞核中的snRNA通常与特定的蛋白质包裹在一起形成颗粒结构,称为snRNPs。电子显微镜观察发现：在rRNA没有完全转录时,snRNA就与rRNA前体结合在一起了。最早与pre-RNA结合的是含有U3的RNP颗粒,这种颗粒主要是结合在前体rRNA的5端,在转录后的加工中,由这种RNP将5端的转录物切除。 反义sn RNA一些低拷贝的snRNA(104拷贝/每细胞)，它们的长度为1021个核苷酸，并且能够与rRNA转录物的特定序列互补，所以属于反义snRNA。这些snRNA与rRNA前体通过互补形成的RNA-RNA双链部分可作为pre-rRNA进行加工修饰的标志(图6-29)。图6-29 pre-rRNA的修饰 (a)在pre-rRNA分子中最常见的修饰是将尿苷转变成假尿苷和在核糖的2位进行甲基化。为了将尿苷转变成假尿苷，必须切开N1-C1键,并将尿嘧啶环旋转1800 ,使C5与核糖的C1共价连接；(b)U20 snRNA与部分pre-rRNA形成部分双链, 导致2核糖甲基化。在任何情况下,甲基化的部位都是与snoRNA氢键连接的pre-rRNA第五位的尿嘧啶(从snoRNA D盒开始)，D盒是snRNA中含有固定的CUGA的序列部分,它的作用是指导pre-rRNA的甲基化；(c)U80 snRNA与pre-rRNA形成部分双链,指导将尿苷转变成假尿苷()。假尿苷的形成也是在固定的位置,同snoRNA的发夹结构有关。指导假尿苷形成的snoRNA都有相同的3末端:ACA。 反义sn RNAs的分类根据反义sn RNA的功能和序列的相似性将它们分成两类:C/D盒sn RNA(box C/D sn RNA)，这类sn RNA的5端有C/D盒结构，它们的功能是决定何种核苷的核糖甲基化;H/HAC盒sn RNA，这类反义sn RNA的3端有HAC序列，它们的作用是决定哪些尿苷被转变成假尿苷。据估计，细胞核中有200多种不同的反义sn RNA，它们分别引导pre-RNA中不同位点的甲基化或假尿苷化。6.4.2 核酶(ribozyme)核酶一词用于描述具有催化活性的RNA， 即化学本质是核糖核酸(RNA)， 却具有酶的催化功能。 核酶的发现 内含子(intron) 内含子是基因内的间隔序列，它不出现在成熟的RNA分子中，也就是说在转录后要通过加工被切除。 外显子(exon) 最后出现在成熟RNA中的基因序列。 核酶的发现: 1981年，Thomas Cech和他的同事在研究四膜虫的26S rRNA前体加工去除基因内含子时获得一个惊奇的发现内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化的26S rRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。 核酶的证实: 为了证明这一发现，他们将编码26S rRNA前体DNA克隆到细菌中并在无细胞系统中转录成26S rRNA前体分子。结果发现这种人工制备的26S rRNA前体分子在没有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。这种现象称为自我剪接(self-splicing)，这是人类第一次发现RNA具有催化化学反应的活性，具有这种催化活性的RNA称为核酶。Thomas Cech 因发现了核酶而获得1989年诺贝尔化学奖。图6-30 所示是四膜虫26S rRNA前体的内含子的二级结构，以及内含子与外显子的剪接点。图6-30 四膜虫26S rRNA前体内含子的二级结构以及内含子、外显子的剪接点（如箭头所指）。核酶是如何被发现及证实的? 这一发现有什么意义? 50S核糖体中23S rRNA的核酶活性 肽酰转移酶(peptidyl transferase) 蛋白质的合成过程中，肽酰转移酶催化核糖体A位tRNA上末端氨基酸的氨基与P位肽酰-tRNA上氨基酸的羧基间形成肽键(图6-31)。图6-31 核糖体A位和P位氨基酸间肽键的形成R1和R2分别表示氨基酸上不同的侧链。 23S rRNA分子的肽酰转移酶活性证实1992年，Harry Noller 和他的同事用蛋白酶K、SDS以及苯酚等去垢剂处理大肠杆菌核糖体50S的亚基,将所有的蛋白质都破坏后,仍然具有肽酰转移酶的活性。与此不同的是，用核酸酶处理核糖体,将rRNA降解后,肽酰转移酶的活性也随之丧失。这些结果提示是RNA而不是蛋白质具有催化肽键形成的作用。在细菌核糖体中，已确定23SrRNA分子中具有肽酰转移酶活性的区域。 核酶的组成分类核酶的种类很多，现在有许多工程核酶。根据核酶的结构和催化反应可分为三种类型: RNA和蛋白质复合物 如核糖核酸酶P(ribonuclease P)。 小分子的RNA 各种具有催化作用的小分子RNA，能够进行分子内自我切割反应，且不需蛋白质参与。这些RNA分子可以分为两个部分，一部分是底物，另一部分是酶。将具有酶活性的序列克隆后可制成人工核酶去作用于独立的底物。 、型内含子 这两种核酶具有将自身从前体mRNA中剪接出去的作用。体外实验证明这种剪接反应仅仅是RNA本身就可以了，但是在体内，需要有辅助蛋白的参与。上述三种类型的核酶都有一个共同的特点，即都涉及磷酸二酯键的切割或连接。它们作用的底物是RNA，可以是RNA分子本身，也可以是别的RNA分子。6.4.3 内含子的切除: 核酶的作用机理除了rRNA前体中有内含子,tRNA和mRNA前体中都有内含子的存在,这些内含子都要通过加工被切除,才能得到成熟的rRNA、tRNA或mRNA。虽然这些RNA中内含子切除的机理各不相同,但都涉及到核酶的作用。 核剪接(nuclear splicing)真核生物的结构基因中一般都含有内含子， 转录后，从pre-mRNA中将内含子切除，然后将外显子重新连接成一个成熟的mRNA的过程称为RNA剪接(RNA splicing)(图6-32)。 图6-32 鸡的卵清蛋白基因初始RNA转录物的剪接 鸡的卵清蛋白基因中有7个内含子，转录后需要被切除，8个外显子连接起来形成有功能的mRNA。核剪接是指发生在细胞核中，主要是对hnRNA中内含子的剪接。有三个主要特点一是在pre-mRNA中内含子与外显子间有特征性序列，即GT-AG规则；第二是剪接过程中需要snRNA参与，并要形成剪接体；第三要形成套索结构。 GT-AG 规则(GT-AG rule