云南省自然科学基金项目申请书定稿zxw.doc

申 请 号项 目 编 号200200云 南 省 自 然 科 学 基 金项 目 申 请 书(项目类别：面上项目) 项 目 名 称：瘦素基因多态性与胆结石及糖尿病合并胆结石关系的研究 申 请 者： 工 作 单 位： 开户银行及帐号： 通 讯 地 址： 邮 政 编 码：650101 电 话：5334416 申 请 日 期：2005年2月云南省自然科学基金委员会二OO一年制填 报 说 明一、 填写申请书前，请先查阅云南省自然科学基金委员会编发的基金项目指南和基金管理办法等，申请该项基金资助的有关规定。申请项目必须符合基金资助范围。申请书各项内容，要实事求是，逐栏认真填写。表达要明确、严谨，字迹清晰易辨。二、 青年基金申请条件：必须是35岁以下取得中级以上职称或硕士以上学位的青年教师和科研工作者。三、 部分栏目填写要求：项目名称应确切反映研究内容，最多不超过25个汉字。项目性质属“基础研究”在A栏打“”、“应用基础研究或基础性工作”在B栏打“”。纯基础研究指以认识自然现象、揭示客观规律为目的；应用基础研究以解决实际问题为导向，围绕生产实践和科学自身发展提出的重大科学问题，探索解决问题的新原理、新方法和基础技术，开拓新的应用领域。基础性工作主要是对基本科学数据、资料系统地进行考察、采集、鉴定，并进行综合分析、探索基本规律。申报学科及代码按云南省自然科学基金学科及代码填写，填写申请项目所属学科的最低层次学科及代码。如有更动，另行通知。申报领域及代码按云南省自然科学基金领域及代码填写。工作单位按单位公章填写全称，其代码按云南省自然科学基金单位及代码填写。隶属关系指申请者所在单位隶属哪个部门，其代码按云南省自然科学基金隶属部门及代码填写。项目主要成员指每年参加研究工作半年以上，在项目组内起主要作用的人员，包含申请者，参与者必须本人签字。四、经费预算表中，其它经费来源一栏，按表列来源渠道已获资助的填明资助金额，已申请但未获准的请打“”，自筹经费，指所在单位和项目合作单位能自已解决的经费，填写金额数。五、项目申请书须经所在单位签署具体意见。加盖公章后一式六份报送云南省自然科学基金委员会或委托的中介机构。 应用基础研究基金申请简表 表一研究项目项目名称瘦素基因多态性与胆结石及糖尿病合并胆结石关系的研究项 目性 质基础研究 A申报学科名称普通外科学申报名称人口与健康应用基础研究或基础性工作 B代码C03030303领域代码03起止年月自2005年7月 至200 8 年7月申请金额06.00万元申请者姓 名性别男年 龄42民族汉代 码01专业技术职务教授代码学位硕士专 业011工作单位代码隶属关系名称云南省卫生厅00502代码详细地址地区码电话01项目组总人数高级中级初级辅助其中博士3合作单位名称中国医学科学院昆明医学生物所11344硕士32主要研 究 内 限容 120和 字意 义 摘要本课题用免疫组化、外周血基因组DNA提取、PCRRFLP法等技术对比性研究瘦素基因的多态性在正常人、胆结石病人及型糖尿病合并胆结石病人中的分布规律及其差异性，并且确定与之相关的易感基因及保护基因，为进一步探索出胆结石病的基因治疗方法奠定理论基础。预期 目 限标 100及 字成 果通过对本课题的研究初步探明瘦素基因多态性在胆结石及型糖尿病合并胆结石病人中的分布规律，为完善胆结石的发病机理奠定理论基础，通过确定易感基因和保护基因，为瘦素的临床应用及相关药物的开发开辟广阔的前景。 1研 究 项 目 组 成 员 登 记 表 表 二 （含 申 请 者）姓 名性别年龄专业技术职 务（职称）现从事专 业工 作 单 位在本项目中的 分 工年参加月数在研项目数本 人签 字12 一、本研究项目的科学依据和意义（包括科学意义和应用前景，国内外研究概况、水平和发展趋势，学术思想，立论根据，特色或创新之处，主要参考文献目录和出处） 1.科学依据和意义：随着生活水平的日益提高，人们的饮食结构和生活方式也在逐渐发生变化，高脂饮食的摄入量增加，运动相减少等多因素作用的结果，使胆石病的发病率逐年上升，已成为肝胆外科的常见病和多发病。与此同时，糖尿病的发病率也随着人们生活水平的改善和人口的老龄化而逐年增加，成为严重影响人们健康状况的疾病之一。研究发现，糖尿病患者较正常人更易于发生胆结石。因此，有关胆结石及糖尿病合并胆结石发病机理及治疗措施的研究，是关系人们生活质量的重要课题。对胆石病的研究，从环境、生活方式、代谢、遗传等方面入手，已取得了相当成绩，使胆石病的防治有了长足进步，但由于其病因和发病机制的复杂性，所采取的预防和治疗措施仍具有较大的局限性。新近的研究显示，胆结石的发生与基因易感性有密切关系，因此，从基因水平探讨胆结石病的发病机制，选择更为合理有效的治疗方法成为肝胆外科领域的前沿课题。1994年Zhang1等人应用定位克隆技术首次成功地克隆出小鼠的肥胖基因(obese gene, ob基因)基因及人类同源序列后，其表达产物瘦素(leptin)已经成为医学界的研究热点 。瘦素具有广泛的生物学效应2,一方面，它能作用于下丘脑的体重调节中枢,引起食欲降低、能量消耗增加从而减轻体重；另一方面, 瘦素 可能作为脂肪胰岛内分泌轴的一部分,参与胰岛素分泌的调节。瘦素抑制胰岛素分泌,而胰岛素可刺激瘦素 的释放，通过瘦素 和胰岛素形成一个双向的反馈环。因此，瘦素在血清中的水平差异与多种疾病密切相关。从1999年开始，国外有学者开始进行血清瘦素水平与胆结石相关性的研究，结果显示，血清瘦素浓度与胆结石具有显著相关性3。Woods等4-6的研究认为瘦素缺陷的小鼠的胆囊对神经肽及胆囊收缩素的兴奋性刺激反应降低，瘦素可能是肥胖者胆囊能动性降低的一个新的因素。Mendez-Sanchez7的研究提示：瘦素通过调节HDL和胆固醇代谢,增加胆固醇逆转运至肝脏,从而增加胆汁分泌胆固醇,升高CSI。多项动物实验证明8：瘦素不仅促进胆汁胆固醇排泌,也改变胆囊胆汁酸盐组成和大小，使胆囊内亲水性胆汁酸盐转变成可溶性胆固醇能力降低,致胆固醇结晶形成,胆石形成。以上方面很可能是血清瘦素浓度与胆结石的发生高度相关的原因。这一结果引起了国内外学者的浓厚兴趣，对瘦素的进一步研究极有可能成为对结石病的发病机制和治疗方法作出重要贡献的突破口。编码瘦素的ob基因位于人第7 号染色体的q31. 3 。长约20kb ,由3 个外显子和2 个内含子组成, 其编码区位于第2和第3 外显子，在部分人群中可见49 位谷氨酰胺密码子的缺失或多出处碱基突变，此多态性的意义尚不清楚。但是，这提示瘦素在质和量上的差异可能是由基因的多态性决定的，既然血清中瘦素水平与胆结石具有显著相关性，则进一步研究瘦素基因多态性与瘦素浓度及胆结石之间的关系就具有十分重要的意义， 然而国内至今尚无有关此课题的研究报道。 本课题欲从瘦素基因多态性入手，研究其与胆结石及糖尿病合并胆结石之间的可能关系，确定二者的易感基因和可能的保护基因，为探索胆结石发病的遗传机理和相应的治疗方法奠定理论基础，同时为瘦素的临床应用及其相关药物开发开辟新的前景。2.本项目的特色和创新之处：（1）首次研究瘦素基因多态性与胆结石及型糖尿病合并胆结石易感性之间的关系，为从基因水平进一步阐明胆结石的发病机理奠定理论基础。（2）可望找出瘦素基因中与胆结石及型糖尿病合并胆结石有关的易感基因和保护基因，为瘦素的临床应用及相关药物开发开辟新的前景。（3）首次对血清瘦素水平与糖尿病患者高发胆囊结石的相关性进行研究。（4）所研究内容在国内处于领先地位，此课题的研究可提高我省在该领域的学术水平。 主要参考文献：1Zhang Y, Proenca R ,Maffei M, et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature, 1994,372:425-432.2Ogawa Y, Masuzaki H, Isse N, et al. Molecular cloning of rat obese cDNA and augmented gene expression in genetically obese zucker fatly(fa/fa) rats.J Clin Invest.1995,96:1647-1652.3Isse N, Ogawa Y,Tamura N,et al.Structural organization chromosomal assuagement of the human gene. J Biol Chem,1995,270:27728-27733.4Targalia L,Dembski I,Weng X,et al. Identification and expression cloning of a leptin receptorJ.cell,1995,83:1-5.5Duggirala R,Mitchell BD,Blangero J,et al.Genetic determinants of variation in gallbladder disease in the Mexican-American populationJ.Genet Epide moil,1999,16:191-204.6Ruhl CE,Everhart JE,Relationship if serum leptin concentration and other measures of adiposity with gallbladder diseaseJ. Hepatology, 2001, 34(5):877-883.7Mendez S N,Veronica,Ana Cristina K M,et al.Plasma leptin and the cholesterol saturation of bile are correlated in obese women after weight loss J.J Nutr,2002,132:2195-2198.8Hyogo H,Cohen,Suheeta Roy,et al.Leptin promotes biliary cholesterol elimination during weight loss in ob/ob mice by regulating the enterohepatic circulation of bile saltsJ.J Biol Chem,2002,277(37):34117-34124 3二、研究内容和预期成果（说明研究项目的具体内容并明确重点解决的科学问题，预期成果和提供的形式。如系理论成果，应写明在理论上解决哪些问题及其科学意义；如系应用性成果或基础性资料，应写明其应用前景及到达的技术指标）1研究内容：1) 采用免疫组化的方法，测定正常人、原发性肝内胆管结石病人、原发性胆囊结石病人、型糖尿病人及型糖尿病合并胆囊结石病人的血清瘦素浓度，对比性研究以上五组病人血清瘦素浓度的差异性及其相互关系。2) 研究血清瘦素水平与型糖尿病患者高发胆囊结石之间的关系。3) 采用全血基因组DNA提取、PCRRFLP法研究瘦素基因多态性在以上五组病人中的分布规律及其相互关系，探明在正常人及糖尿病人中瘦素基因多态性与胆结石易感性之间的关系，从基因水平进一步完善胆结石的发病机制。4) 通过检测瘦素基因序列各核苷酸的等位基因及其变异频率，可望找出胆石病的易感基因和保护基因，为进一步探索出胆结石的基因治疗方法及相关药物的开发奠定理论基础。2预期成果：1）首次通过研究探明瘦素基因多态性在胆结石及型糖尿病合并胆囊结石病人中的分布规律，为完善胆结石的发病机理奠定理论基础。2）可望确定其易感基因和保护基因，同时为瘦素的临床应用及其相关药物开发开辟新的前景。3）首次探明血清瘦素水平与型糖尿病人高发胆囊结石之间的关系4）通过本课题的研究，为其他相关学科对瘦素的研究提供借鉴。5）实施该项目的过程，也是加快我省培养高层次人才的过程；预计可培养硕士生3名，撰写并发表学术论文4-6篇，参与全国交流，申报科技进步奖，提高我省在该领域的知名度。4三、拟采取的研究方法和技术路线（包括理论分析、计算、实验方法和步骤及可行性论证，可能遇到的问题和解决的办法）一研究方法和技术路线：1实验分组采用随机方法，将临床收治病人分成五组：即正常人组、胆囊结石组、原发性胆内胆管结石组、型糖尿病组、型糖尿病合并胆囊结石组（每组n=25,女性，年龄50-60岁，所有研究对象均除外胆结石及糖尿病之外的其他疾病及其家族史）。2血清瘦素浓度及其他相关指标测定所有受试者停用降脂降压及降糖药24小时后，次日8：00抽取空腹静脉血，分别送本院生化室测定血糖、血脂，内分泌研究室测定胰岛素及C肽等。部分血标本存放在-80摄氏度液氮灌内 ，留做瘦素浓度测定。3瘦素基因多态性测定（1）四组研究对象分别进行外周血基因组提取。（2）基因多态性检测。分两步进行：1）首先合成引物,用于扩增瘦素基因启动子部分。上游引物5 3,5 3。合成的引物经10倍扩增后置入仪进行循环。循环条件为变性9445,复性5545,延伸7260,共35次循环,循环之前预变性94180,循环之后最后延伸72300。2）取扩增产物约5加入6上样缓冲液1,在3%琼脂糖凝胶上点样,40伏电压下电泳20,在紫外灯下观察结果。与对照,如有目标带则进一步进行下述的酶切反应。取扩增产物约10加入0.5(10/),置恒温水浴箱37保温3,再取酶切反应液约7做琼脂糖凝胶电泳,根据条带判断基因型。4统计学处理：临床变量以(-)表示。对非正态分布变量进行对数转换。用基因计数法计算基因型频率和等位基因频率。计量资料采用t检验，计数资料采用2检验，统计和分析瘦素基因序列各核苷酸的等位基因及其变异频率，从而探明瘦素基因多态性在各实验组研究对象之间的分布规律和差异性及其与瘦素浓度之间的关系。二可行性分析：本课题是申请者长期从事肝胆疾病研究、肝门胆管解剖研究及分子生物学研究工作基础上的进一步深入，已完成的前期工作为本课题奠定了良好的基础。实验中涉及的技术和方法在本院肝胆研究所和中国医学科学院昆明生物所已建立。实验仪器和设备在研究所及昆明生物所即可满足。若给予资助，定能达到预期的目的。三可能遇到的问题和解决的办法: 因在国内首次开展此课题的研究，可借鉴的文献较少，且基因多态性是一个较复杂的课题，所涉及的问题很难在一次研究中全部得到解答。故本课题的研究应重点对研究内容中所提及的几个大方面的问题进行探讨并得出结论。昆医附二院和中国医学科学院昆明生物所的强强联合是本课题圆满完成的重要保证。 5四、研究工作年度计划安排（在研究工作期限内，按年度阐明研究工作具体内容）(1) 研究工作和总体安排（计划三年内完成）20052006.：化学试剂，检测试剂盒的购置。完成引物合成。开始临床收集胆结石和型糖尿病合并胆结石病例。20062007：完成临床病例搜集工作，进行血清瘦素浓度及瘦素基因多态性的检测，对实验结果进行统计。 20072008：对结果进行统计学分析，完成论文。 (2) 分年度计划安排 2005年7月2006年1月：化学试剂，检测试剂盒的购置。完成引物合成。开始临床收集胆结石和型糖尿病合并胆结石病例。 2006年1月2007年7月： 完成临床病例搜集工作，进行血清瘦素及血糖，胰岛素等相关指标的检测。 2007年7月2008年1月：完成PCR-RFLP，对实验结果进行统计。 2008年1月2008年7月：结果分析及完成论文撰写。6五、实现本项目预期目标已具备的条件（包括与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩，已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径以及主要研究队伍状况） 7六、申请者和项目组主要成员业务简历以及在本项目中承担的任务（按人填写主要学历和研究工作简历，近期发表的与项目有关的主要论著目录和科研成果名称，并注明出处及获奖情况。如承担过科学基金资助项目，应写清楚完成情况和国内外评价、引用及应用情况） 8 七、 对申请者负责的前一个已结题云南省自然科学基金资助项目（项目名称及项目编号）完成情况、验收等级、后继研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。 八、申请者承诺 我保证上述填报内容的真实性。如果获得资助，我与本项目组成员将严格遵守云南省自然科学基金有关管理办法的规定，切实保证研究工作时间，按计划认真开展研究工作，按时报送有关材料。 申请者（签章）： 2005 年 2 月 28 日 9九、申请项目经费预算表申请资助金额其 中其他经费来源 （万元）2005年2006年2007年2008年200 年国家自然基金资助国家行业基金资助省内部门资助自筹经费 6 万元3.62.4 预算支出科目：金 额(万元)支出计算的依据1.仪器设备费0.5简易小型仪器及零部件的购置费，仪器设备的维护费。2.实验材料费2.0一次性耗材，化学试剂费，检测试剂盒的购置费。3.科研业务费3.2化学试剂，检测试剂盒的购置，观察指标的测试费；本项目必须的学术会议，业务资料费。 4.协作费 5.管理费0.3由单位统一掌握。合 计6.0填表说明：1.仪器设备费：指资助专用的简易仪器设备的购置和运杂等费，自制设备的材料及加工费。2.实验材料费：指科研用消耗材料、试剂、药品等购置费，标本、样品采集加工和运杂费。3.科研业务费：包括动力设备和燃料试验所需的动力、燃料费、实验用动、植物购置费、养殖费、计算、测试、分析费（使用本单位设备应不收或只收消耗费），本项目必需的学术会议、业务资料等费。4.其他：管理费不超过资助金额的5，由单位统一掌握。未签订协议的协作费以及资助项目批准前已发