连接产物的转化.doc

连接产物的转化 实验原理：1、即受体菌在低温下（0）被置于低渗的CaCl2溶液中，细菌在低渗环境中菌体膨胀成球形。2、转化体系中的DNA与Ca2+形成羟基钙磷酸复合物黏附于细胞表面，之后使细菌经42短时间热冲击处理(热休克)，此时受体菌可大量吸收其表面黏附的DNA复合物，完成转化。继而在培养基上生长一定时间(数小时)后，菌体恢复原状，并可以分裂增殖。3、由于载体上含有氨苄青霉素抗性基因和LacZ基因的部分片段，所以可以利用抗性和蓝白斑进行含有重组质粒的大肠杆菌菌落的筛选。1、互补：指E.coli -半乳糖苷酶的两个无活性的片段组合而成为功能完整的酶的过程。pGEM-T载体上的T位点位于可产生肽段的基因片段之内。若有外源基因插入此则破坏编码读框产生没有活性的肽段。2、宿主菌为缺失产生肽段的突变体，但能产生酶的其它肽段（肽段）。2、载体与宿主菌两者之间进行基因内互补就产生有活性的-半乳糖苷酶。在IPTG的诱导下，载体产生的肽段与宿主菌产生的肽段结合成有活性的-半乳糖苷酶，此酶能使显色底物X-gal分解成不溶于水的蓝色化合物，从而使菌落变蓝。若有外源片段插入此位点，则使载体的-半乳糖苷酶基因失活，不能产生肽，也就不能形成有活性的-半乳糖苷全酶，X-gal不能被分解，菌落为白色。实验步骤：1、从-80冰箱中取出感受态细胞放于冰上，使其缓慢融化。2、分装感受态细胞，每个小管30L。分别加入连接产物3L，轻轻混匀，冰上30min。3、42 1min。4、冰上2.5min，加入SOC培养基470L。5、37摇床摇动1小时。6、将培养液分成等份后涂于LB培养基上，液体全干后，将平板过夜、倒置培养于37恒温箱中。7、第二天早上观察培养结果。培养基配制：组分浓度：1% （W/V） Tryptone0.5%（W/V） Yeast Extract1% （W/V） NaCl0.1 mg/mL Ampicilli一、LB/Amp/X-Gal/IPTG培养基:配置量（g）1000mL250mL150mL50mL液体胰蛋白胨102.51.50.5酵母粉51.250.750.25Nacl102.51.50.5固体琼脂粉153.752.250.75加ddH2O搅拌溶解，滴加5M NaOH，调节PH值至7.0。加ddH2O定容。高温高压灭菌。冷却至60，加入1mL Ampicillin（100g/mL）、1mL IPTG（24mg/mL）、X-Gal（20mg/mL）后，混匀，倒平板。（3035mL培养基/ 90mm培养皿）。4避光保存。LB固体培养基灭菌后，自然凉至60时，加入氨苄青霉素（终浓度是50g/ml）,倒平板。等到培养基凝固后，在其上涂X-gal和IPTG的混合物（两种物质各30l，在离心管中混合好后取60 l混合物涂扳）组分浓度： 2% （W/V） Tryptone0.5% （W/V） Yeast Extract0.05% （W/V） NaCl2.5 mM KCl10 mM MgCl2二、SOB培养基：配制量：1L方法：1、配制250mM KCl溶液：90mLddH2O+1.86gKCl 定容至100mL。2、配制2M MgCl2溶液：90mLddH2O+19gMgCl2定容至100mL。3、称量：Tryptone：20g Yeast Extract：5g NaCl：0.5g4、加入约800mL ddH2O，搅拌溶解，量取10mL KCl（250mM）溶液，加入烧杯中，滴加5M NaOH调PH值至7.0，加入ddH2O定容至1L，高温高压灭菌。4 保存。使用前加入5mL灭菌的2M MgCl2溶液。组分浓度：2% （W/V） Tryptone0.5% （W/V） Yeast Extract0.05%（W/V） NaCl2.5 mM KCl10 mM MgCl220 mM 葡萄糖三、SOC培养基配制量：100mL方法：1