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蓝莓组培技术具体培养介绍一、愈伤组织的培养 （一）几个概念 1.外植体（explant）：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。 2.分化（differentiation）：细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而在个发育中形成各类组织和器官完成整个生活周期。 3.脱分化（dedifferentiation）:已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分化组织状态的过程。 4.再分化（redifferentiation）:脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。 5.愈伤组织（callus）:在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在外植体切面上产生。 6.胚状体（embroid）:-对应于胚（embryo），在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。胚状体原始细胞特征：原生质浓厚，细胞核较大，处于细胞质中央。 7.人工种子(artificialseed):指将植物离体培养产生的体细胞胚包埋在含有营养成分和保护功能的物质中,在适宜条件下发芽出苗的颗粒体。 （二）愈伤组织类型及特征 1.结构致密型：表面光滑有光泽，结构致密，多为淡黄色或白色，易于再生芽 2.结构松散型：多为白色，可以用于悬浮系建立。 3.胚性愈伤组织：具有产生胚状体能力。 （三）愈伤组织的形成：大致经过起绐期、分裂期和形成期，但三个时期没严格界限。 1.起始期指细胞准备进行分裂的时期，当外植体已分化的活细胞在外源植物生长物质的作用下，通过脱分化起动而进入分裂和形成愈伤组织。 2.分裂期表现为外层细胞出现分裂，细胞分裂进入最旺盛时期，细胞体积最小，细胞核和核仁较大，RNA含量最高。 3.形成层的特征是细胞大小趋于稳定,细胞分裂从分裂期的周缘细胞分裂为主转向了内部组织。 （四）愈伤组织中的形态发生：愈伤组织通过再分化形成再生植株的方式主要有： 1.先产生芽后,在茎的基部长根。 2.先长根,再长芽。 3.愈伤组织的不同部位分别形成根和芽。 （五）胚状体特点 1.有分化明显的生物两端，根端和芽端。2.单细胞起源。3.发育程序同合子胚相似，也经过球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚。4.和周围细胞之间有隔离。5.和培养物质没有维管束联系，所以容易从培养物质上剥离。6.可以在不附加任何激素的培养基上萌发。 （六）胚状体发生途径 1.直接胚状体发生。2.间接胚状体发生（愈伤组织分化出胚状体）。3.从悬浮培养的细胞中诱导。4.由花粉产生的单倍体胚状体。5.由原生质体产生胚状体。 （七）胚状体异常现象 1.单片子叶；2.多子叶；3.杯状胚状体；4.柱状胚状体。 二、器官培养 器官培养主要指植物根、叶、茎、花及小果实等器官在离体条件下的无菌培养。其特点在于能保持器官所具有的特征结构。 1.根的培养(以番茄离体根培养为例) (1)种子用70%酒精消毒;(2)用饱和漂白液消毒10分钟;(3)用无菌水洗三次;(4)将6-10粒种子放入培养皿中的湿滤纸上;(5)培养皿放入暗中培养直至胚根长至30-40mm;(6)切取10mm长的根尖用无菌的接种环接种于培养液中;(7)在25度下培养直到长出侧根。 影响根分化的因素 培养基的成分：基本培养基生长调节物质生长素细胞分裂素 培养条件：光经常抑制根生长温度2130均可诱导生根 2.茎的培养(可分为茎尖培养和茎段培养) 茎段培养是指带有腋(侧)芽或叶柄、长数厘米的茎节段进行离体培养。 培养流程： 3.叶的培养三、花药和花粉培养 （一）几个概念 单倍体细胞：植物的花粉母细胞经减数分裂形成的，其染色体数目只有体细胞的一半。 花粉和花药培养：指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精而发生细胞分裂，由单个花粉发育成完整植株的技术。 单倍体植物：用离体培养花药的方法使其中的花粉发育在一个完整的植株。 （二）影响花粉和花药培养的因素有哪些? 1.不同基因型对培养反应不同。2.材料的生理状态。3.发育阶段。4.培养基：基本培养基激素蔗糖其它：铁盐、活性炭。5.预处理：花蕾低温处理27天为宜，也可高温、辐射、黑暗处理。6.培养方式：固体培养、液体培养。 （三）什么时期花粉易单倍体培养成功? 单核期小孢子。 （四）花药培养中非单倍体出现的原因有哪些? 1.花药愈伤组织的多倍化核内有丝分裂。2.核融合-产生多倍体。3.不正常的非单倍体花粉产生的植株。4.花药壁、花丝等二倍体体细胞参与愈伤组织的形成。5.愈伤组织染色体的变化。 （五）花药培养中花粉发育途径有哪些。 1.均等分裂发育途径，2.营养核分裂发育途径，3.生殖核分裂发育途径，4.营养核和生殖核发育途径。 （六）单倍体植株染色体加倍方法是什么? 1.自然加倍：发生频率低，主要是由核内有丝分裂产生的。也有花粉内营养核和生殖核二者的融合而达到加倍目的。 2.人工诱导加倍：用0.5%秋水仙素溶液处理植株。 使用方法：植株处理：植株用0.5%秋水仙素处理2448h洗净后种植。 花序处理：植物倒置使花序浸入0.1%秋水仙素溶液中2448h。 生长点处理：用0.10.4%秋水仙素和羊毛脂（3：2）涂抹。 3.从愈伤组织再生二倍体植株：用单倍体植株茎段培养使之产生愈伤组织，愈伤组织中可发现核内有丝分裂，从而造成染色体加倍。 （七）如何利用花粉培养直接获得纯合二倍体？ 切取花蕾组织在不同转速下离心分离出纯花粉染色体加倍培养纯合二倍体植株。 四、细胞培养 (一）悬浮培养 1.悬浮培养的基本特点 是从愈伤组织的液体培养的基础上发展起来的一种培养技术，主要有两个基本特点： 1）细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模生产 2）可以提供大量的比较均匀的细胞，为深入研究细胞的生长、分化创造了一种很好的实验方法和条件；愈伤组织只能提供细胞间可能已明显分化的细胞。但是，这种理想状态不容易得到。到目前为止，还不能完全做到只有游离的单细胞，通常里面还有小细胞团，这是由于植物细胞具有聚集在一起的特性。 2.悬浮培养的目的 主要用于生产次生代谢产物，所以保持细胞停留在增殖阶段是十分重要的，细胞勿需继续分化 3.悬浮系的制备 将疏松的愈伤组织放入液体培养基中，经过摇床不断振动，使细胞分散。 一般来说，分散比较好的细胞悬浮物是由薄壁细胞组成的。但有时还存在一些木质化的类管胞等成分，这些类管胞成分是引起细胞聚合的重要因素。通常适于愈伤组织生长的液体培养基也适用于同种植物细胞的悬浮培养。有时需要调节激素的浓度。 （二）单细胞培养 1.分离单细胞的方法 1）物理方法： 将疏松的愈伤组织放入液体培养基中，经摇床不断振动，使细胞分散。若向细胞悬浮液中吹入脉冲压缩气体，细胞分散的更好。 2）化学方法： 胡萝卜细胞悬浮培养中加入草酸钙（100g/L）得到较分散的细胞。因为草酸盐能结合细胞间质中果胶钙的钙离子。 秋水仙素（0.1mmol/L）或2,4-D或水解乳蛋白对细胞分散有一定的作用 3）酶法： 果胶酶和纤维素酶有利于细胞分离，但使用浓度不当容易引起细胞降解。 2.单细胞的培养方法 1）液体浅层培养： 先将细胞制成一定密度的细胞悬浮液，用吸管将悬浮液移到培养皿中形成浅层，一般1mm左右，石蜡膜封口，静置培养。 优点：培养物与空气接触面大，通气性好；细胞代谢产物容易扩散，不会造成有害物质的危害,继代培养方便、便于观察。 缺点：由于细胞可以游动，不能进行定点观察 2）微室培养（微滴培养）：40-100l 优点：可以连续观察细胞的分化和发育；缺点：通气性差。 3）平板培养： 优点：便于定点观察；缺点：通气性较差 4）看护培养；适用于难于培养的植物种类 3.培养细胞的密度及生活率的测定 1）起始密度的测定：起始密度一般为104-108个/ml 用记数板统计细胞数目 2）植板率的测定： 用平板培养的需要统计植板率，即每个平板接种细胞总数中形成细胞团的百分数。 4.植株再生 获得了细胞团以后继续培养形成愈伤组织 将大块的细胞团或愈伤组织转到分化培养基上再生植株。 五、原生质培养和体细胞杂交 （一）原生质体及其特点 原生质体是去掉了细胞壁后剩下的细胞部分。 特点：1.易于摄取外来遗传物质、细胞器、细菌、病毒等2.在一定条件下可诱导原生质体融合，形成杂种细胞 （二）原生质体培养的步骤 1.原生质体的分离 以芸薹属植物为例： 2.原生质体培养 将纯合后的原生质体以5-6104/ml的密度用培养基浅层培养 3.愈伤组织的产生及植株再生 当小愈伤组织长到直径1mm时转到固体培养基上增殖培养，然后再转入分化培养基上再生植株。 （三）原生质体融合：又叫体细胞杂交 1自发融合： 酶解过程中，常有相邻的同缘原生质体互相粘连，最后融合在一起形成同核体 有时也出现多核融合体。 2诱导融合： （1）PEG法：把两种原生质体放在一起，加入诱导融合剂如PEG（聚乙烯二醇），在高Ca+、高pH条件下，异源原生质体容易发生融合，形成异核体。 （2）电融合法：利用交变电流 植物快繁的途径和方法 植物快速繁殖就是应用组织培养技术,快速繁殖名优特新品物,使其在较短时间内繁衍较多的植株。快繁是当前植物工程中应用最广泛，又最有效的方法之一。 一、植物快速繁殖的类型与方式 类型方式特点事例 器官型腋芽萌发，以芽增殖芽，扩大繁殖系数繁殖系数高，遗传性稳定，是快繁的主要方式甘蔗、香蕉、香石竹、丝石竹 器官发生型通过脱分化形成愈伤组织，再分化出苗可获得与母株相同的小植株，繁殖系数较低，可用于细胞分化的研究烟草、油菜等 胚状体发生型从愈伤组织或直接从子叶、下胚轴和花药培养中产生首先证明植物细胞的全能性，繁殖系数高甘蔗、胡萝卜、石刁柏等 原球茎型由茎尖或腋芽产生原球茎放入培养基中发育成小植株遗传性较稳定，原球茎可作为繁殖系母体兰花 球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起（球茎芽），一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠 块茎型叶片或叶柄上形成粒状芋块，进一步分化出芽和根块茎芽可为繁殖系母体，不断切割繁殖移栽，成活率高花叶芋 鳞茎型鳞片近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎在试管内形成小鳞茎需较长时间百合、郁金香、贝母等 孢子型用成熟或未成熟的孢子进行培养孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时间较长地钱、狼尾蕨等 根茎型蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为组培的最佳外值体根状茎上产生蕨叶及根，繁殖速度较孢子型快肾蕨、裂叶肾蕨、波士顿蕨等 微枝扦插型带芽的小插条在试管内进行无菌扦插为木本植物进行快速繁殖的主要方式葡萄、杨树 二、继代培养：当初代培养的试管苗在瓶内长满到瓶塞，或培养基养分利用完时就要转瓶，这就是继代培养。在此过程中会产生两种现象，即驯化现象和衰退现象。 驯化现象：开始继代培养要加入生长调节物质，其后加入少量或不加入就可以生长的现象。 衰退现象：长期继代培养的材料也会逐渐衰退，丧失形态发生能力，具体表现在生长不良，再生能力和增殖率下降等。 二、培养物的脱毒及脱毒苗的鉴定 一、为什么茎尖培养除去病毒：因为病毒运转速度慢，加上茎尖分生组织没有维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞分裂和生长的速度，所以生长点的病毒数量极少，几乎检测不出来。 二、无病毒苗的获得：（1）材料的培养和灭菌；（2）茎类剥离；（3）茎尖培养；（4）提高脱毒效果：高温、低温、化学处理。 三、其他途径脱毒：（1）愈伤组织脱毒；（2）珠心胚培养脱毒；（4）茎尖微体嫁接脱毒；（5）培育抗病毒栽培种。 四、脱毒苗的鉴定：（1）直接测定法；（2）指示植物法；（3）抗血清鉴定法；（4）酶联免疫吸附法；（5）电子显微镜检查法；（6）免疫吸附电镜法。 三、种质保存 一、种质是指亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。植物种质保存是利用天然或人工创造的适宜环境，使个体中所含有的遗传物质保持其遗传完整性，有高的活力，能通过繁殖将其遗传特性传递下去。种质保存主要有两种方式：原地保存和异地保存。前者通过建立自然保护区和天然公园来实现，后者通过植物园、种质圃、种子库以及离体保存来实现。 二、种质保存的主要方法：（1）常温保存；（2）常低温和低温保存；（3）超低温保存。 稀酸、稀碱的配制及酒精稀释法 在培养基的配制过程中，常需要用氢氧化钾或氢氧化钠和盐酸来来调整培养基的酸碱度。 1.1摩尔/升KOH液的配制:称取57.1克KOH,加蒸馏水至1000毫升. 2.0.1摩尔/升KOH液的配制:取10毫升1摩尔/升KOH液加蒸馏水90毫升. 3.1摩尔/升NaOH液的配制:称取40克NaOH,加蒸馏水至1000毫升. 4.0.1摩尔/升NaOH液的配制:取10毫升1摩尔/升NaOH液加蒸馏水90毫升. 5.1摩尔/升HCL液的配制:取浓盐酸(比重1.19)82.5毫升加蒸馏水至1000毫升.配制时先将浓盐酸缓缓加入约800毫升的蒸馏水中,然后用蒸馏水补足至1000毫升. 6.0.1摩尔/升HCL液的配制:取10毫升1摩尔/升HCL液加蒸馏水90毫升. 7.酒精是组培工作中常用的消毒液,广泛用于外植体材料、接种用具及接种人员双手的消毒，也用于培养室的酒精喷雾消毒等。酒精的消毒效果以70%为最好。所以常将市售95%的酒精稀释至70%-75%。 常见培养基中植物激素配方类型 激素配方再生方式及用途 1.无植物激素：诱导生根、无性胚、愈伤组织形成 2.单加生长素:：诱导生根、愈伤组织、无性胚、不定芽 3.单加细胞分裂素；诱导不定芽、侧芽增殖、愈伤组织形成 4.高生长素低细胞分裂素：诱导芽、原球茎增殖、愈伤组织形成 5.低生长素高细胞分裂素：诱导丛芽、愈伤组织形成 6.低生长素低细胞分裂素：诱导不定芽、侧芽增殖 7.等量生长素与细胞分裂素：诱导侧芽增殖 8.加生长仰制剂（多效唑、矮壮素等）：壮苗、延缓生长、利于试管苗保存 9.加GA3：打破种子、芽休眠，促进伸长生长 培养物的不良表现及改进措施(初始培养阶段) 1.培养物水浸状、变色、坏死、茎断面附近干枯 可能原因：表面杀菌剂过量，消毒时间过长，外植体选用不当（部位或时期）。 改进措施：调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，试用其他部位，生长初期取材。 2.培养物长期培养几乎无反应 可能原因：基本培养基不适宜，生长素不当或用量不足，温度不适宜。 改进措施：更换基本培养基或调整培养基成分，尤其是调整盐离子浓度，增加生长素用量，试用2,4-D，调整培养温度。 3.愈伤组织生长过旺、疏松，后期水浸状 可能原因：激素过量，温度偏高，无机盐含量不当。 改进措施：减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是铵盐）含量，适当提高琼脂用量增加培养基硬度。 4.愈伤组织太紧密、平滑或突起，粗厚，生长缓慢 可能原因：细胞分裂素用量过多，糖浓度过高，生长素过量。 改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素比例，降低糖浓度。 5.侧芽不萌发,皮层过于膨大,皮孔长出愈伤组织 可能原因:枝条过嫩,生长素、细胞分裂素用量过多。 改进措施：减少激素用量，采用较老化枝条。 培养物的不良表现及改进措施(继代培养阶段) 1.苗分化数量少、速度慢、分枝少、个别苗生长细高 可能原因：细胞分裂素用量不足，温度偏高，光照不足。 改进措施：增加细胞分裂素用量，适当降低温度，改善光照，改单芽继代为团块（丛芽）继代。 2.苗分化过多，生长慢，有畸形苗，节间极短，苗丛密集，微型化 可能原因：细胞分裂素用量过多，温度不适宜。 改进措施：减少或停用细胞分裂素一段时间，调节温度。 3.分化率低,畸形,培养时间长时苗再次愈伤组织化 可能原因:生长素用量偏高,温度偏高。 改进措施：减少生长素用量，适当降温。 4.叶粗厚变脆 可能原因：生长素用量偏高，或兼有细胞分裂素用量偏高。 改进措施：适当减少