（水生生物学专业论文）拟南芥雄性不育突变体遗传分析及相关基因的克隆.pdfVIP

上海师范大学顾十学位论文 摘萤 摘要 随着模式植物拟南芥基因组全序列测定的完成，基因功能研究成为当前生命 科学的前沿领域。本论文以正向遗传学的方法研究花药及花粉发育过程的基因功 能，主要利用图位克隆的方法从拟南芥雄性不育突变体中克隆相应的基因。 首先对1 9 个经化学诱变剂e m s 处理得到的雄性不育突变体进行背景纯化和遗 传分析，从中筛选到四个单个隐性基因控制的雄性不育突变体( e c 2 1 5 7 、e c i 一1 8 8 、 e c 2 一1 1 5 和e c 2 2 1 4 ) 。细胞学观察表明，e c 2 1 5 7 花药中不能形成花粉粒，e c i 一1 8 8 突变体中只有少量的花粉粒，但花粉粒的内容物较少；e c 2 1 1 5 和e c 2 2 1 4 突变体 中能够形成花粉粒。 为了从突变体中克隆基因，我们建立了一套分子标记( 共2 4 个) 用于突变基 因的初定位。其中本次实验发展了1 8 个分子标记。利用这套分子标记，将四个不 育突变体e c 2 1 5 7 、e c i 一1 8 8 、e c 2 1 1 5 、e c 2 2 1 4 相应的突变基因分别定位于拟南 芥的第1 v ，v ，v ，i 号染色体上。这套分子标记比较稳定，容易检测，目前也用 于拟南芥其他突变基因的定位。 然后对突变体e c i 一1 8 8 的突变基因( m s l 8 8 ) 进行了精细定位。在与m s l 8 8 连 锁的分子标记m c o l 5 附近设计了8 个i n d e l 分子标记，对遗传群体中2 1 3 5 株不育 植株进行基因型分析，最后将目的基因定位于第五条染色体分子标记m d a 7 和k 2 4 c i 之间9 5 8 k b 的区间内。该区间共有2 8 个基因，其中一个是转录因子a t m y b l 0 3 。 利用p c r 的方法从突变体中扩增a t m y b l 0 3 基因并进行序列分析，结果表明突 变体中a t m y b l 0 3 基因第二个外显子上发生了点突变，由原来编码谷氨酰胺的c a a 密码子突变为终止密码子t a a 。因此，我们推测，e c 一1 8 8 突变体可能是转录因子 a t m y b l 0 3 基因发生突变的结果。进一步的遗传互补以及功能分析正在进行之中。 关键词拟南芥；雄性不育；花粉：分子标记：图位克隆；转录因子 【一海师范人学颂十学位论文 摘琵 a b s t r a c t w i t ht h ec o m p l e t i o no ft h em o d e lp l a n ta r a b i d o p s i sg e n o m es e q u e n c i n gi n2 0 0 0 ， t h e e m p h a s i s o ft h el i f es c i e n c eh a sb e e ni n t ot h ef u n c t i o n a l g e n o m i c s i n t h i s d i s s e r t a t i o nw ef o c u s e do nt h ef u n c t i o no fg e n e sa s s o c i a t e dw i t ha n t h e ra n dp o l l e n d e v e l o p m e n ti n c l u d i n gm a p b a s e dc l o n i n go fa r a b i d o p s i sg e n e s f r o mm a l es t e r i l e m u t m a t s f r o m1 9 a r a b i d o p s i s m a l es t e r i l el i n e si s o l a t e df r o ma n e t h y l m e t h a n e s u l p h o n a t e i n d u c e d ( e m s i n d u c e d ) p o p u l a t i o n ，at o t a l o ff o u rm a l es t e r i l e m u t a n t sw e r es c r e e n e dw i t he a c hm u t a n tc o n t r o l l e d b y a s i n g l e r e c e s s i v e g e n e c r o s s - s e c t i o no ft h e s em a l es t e r i l em u t a n ta n t h e r ss h o w e dt h a tt h e r ei sn o p o l l e n f o r m a t i o ni nm s l 5 7a n t h e rw h i l em s l 8 8a n t h e rc o n t a i n saf e w p o l l e ng r a i n sw i t hp o l l e n s h a p ed i s t o r t e da n dr e d u c e dc y t o p l a s m i cc o n t e n t h o w e v e r ，p o l l e nw a sf o r m e di nb o t h a n t h e r so f m s l l 5a n dm s 2 1 4 i no r d e rt oi s o l a t et h e s eg e n e s ，w ee s t a b l i s h e das e to fm o l e c u l a rm a r k e r sf o rt h e f i r s t p a s sm a p p i n go fa r a b i d o p s i sg e n e s o ft h e2 4i n d e lm a r k e r s ，at o t a lo f18w e r e d e v e l o p e di n t h i sw o r k t h em u t a t e dg e n e sm s l 5 7 ，m s l 8 8 ，m s l1 5a n dm s 2 1 4w e r e m a p p e do nc h r o m o s o m ei v 、v 、v 、i ，r e s p e c t i v e l y ，u s i n gt h em o l e c u l a rm a r k e r s d e v e l o p e da b o v e t h i ss e to fm o l e c u l a rm a r k e r si ss t a b l e ，a n de a s yt ou s e t h e ya r ea l s o u s e df o ro t h e r g e n em a p p i n g i na r a b i d o p s i s t h em s l 8 8 g e n ew a sf i n e l ym a p p e d a t o t a lo f 8n e wi n d e lm a r k e r sw e r e d e s i g n e d t om a pm s l 8 8 u s i n g as e g r e g a t i n g p o p u l a t i o nw i t ha t o t a lo f 2 1 3 5m a l es t e r i l ep r o g e n i e s m s l 8 8 w a s f i n a l l y m a p p e d t o a r e g i o no f 9 5 8 k bb e t w e e f i t h e m o l e c u l a r m a r k e r m d a 7 a n dk 2 4 c 1 t h e r ea r eat o t a lo f2 8g e n e si nt h i sr e g i o ni n c l u d i n ga t r a n s c r i p t i o nf a c t o r a t m y b l 0 3 p c rm e t h o dw a su s e dt oi d e n t i f yc a n d i d a t em s 18 8 s e q u e n c ea n a l y s i si n d i c a t e d t h a ta p o i n tm u t a t i o no c c u r r e di nt h es e c o n de x o no f t h ea t m y b l 0 3g e n ei nm a l es t e r i l e m u t a n tw i t h c a a ( g l n ) r e p l a c e db y a s t o p c o d o nt a a t h u s ，w eb e l i e v et h a t a t m y b10 3i st h ec a n d i d a t eg e n ef o rm s 18 8 t h eg e n e t i cc o m p l e m e n t a t i o na n dg e n e f u n c t i o na n a l y s i sa r eb e i n gu n d e r t a k e n k e y w o r d s ：a r a b i d o p s i s ，m a l es t e r i l e ，p o l l e n ，m o l e c u l em a r k e r ，m a p b a s e dc l o n i n g ， t r a n s c r i p t i o nf a c t o r 上海师范大学联十学位论文 u 舌 刖舌 拟南芥是十字花科植物，虽然不具有直接的经济价值，但由于其具有一些独 特的生物学、遗传学及分子生物学性质，而成为植物分子遗传学研究中最受欢迎 的模式植物( m o d e lp l a n t ) ( m e y e r o w i t z ，1 9 8 7 ；k o n c z ，1 9 9 2 ) 。尤其是在2 0 0 0 年底，拟南 芥全基因组测序工作的完成，为拟南芥基因克隆、结构与功能的研究提供了便捷 的条件，使其成为当前国际上植物功能基因分离以及生长发育研究的首选对象。 花药及花粉的发育是植物基因功能研究的一个重要研究方向。花药及花粉发育异 常会导致雄性不育，雄性不育是生产上杂交制种的基础。因此对花药及花粉发育 的深入研究既有理论研究意义，又有实际应用的价值。突变体是研究花药及花粉 发育机理的一个有效方法。通过分离雄性不育突变体可以分离花粉和花药发育所 必需的基因。拟南芥花药及花粉发育过程中估计有3 5 0 0 个左右的特异表达基因 ( s a n d e r s ，1 9 9 9 ) ，而其中至少6 0 个基因为花粉发育所必需，这些基因的突变会导致 雄性不育( w i l s o n ，2 0 0 1 ) 。目前国际上已经克隆了二十多个雄性不育基因，但仍有许 多不育基因没有被克隆。利用图位克隆的方法从突变体中克隆这些花药及花粉发 育所必需的基因，必将极大地促进花药及花粉发育分子机理及生理生化的研究。 1 1 拟南芥介绍 1 1 1 拟南芥特征 拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 是十字花科拟南芥属的1 个种。其植株小、成熟卜 体高约3 0 c m 左右。形态特征简单，拟南芥的生长周期很短，从播种到收获种子一 般只需6 周左右，且产生的种子数量多，每株每代可产数千粒种子。拟南芥的这 一生物学特性，使以它作为实验材料进行遗传分析时，可以大大缩短时间，相比 之下小麦、玉米等植物的生长期一般需几个月，使得遗传实验分析花费的时间较 长。拟南芥是1 种典型的自交繁殖植物，因此人工诱变后可以在子二代中直接筛 选变异株的纯合子。同时根据遗传分析需要人工杂交也很容易完成。在目前已知 基因组大小的高等植物中，拟南芥的核基因组最小，其单倍体基因组只有( 1 2 5 m b ) 左右。由于基因组小，使其基因库的构建、筛选等过程变得简单、快速。 拟南芥具有上述特点，很容易利用人工诱导产生遗传变异。通过物理的( 如辐 上海师范人学坝i 学位论文前高 射处理) 、化学的( 如e m s 处理) 及生物的( 如利用植物内源转座子或外源d n a 片段 插入法) 等手段进行人工诱变处理，已经获得了大量发生在不同基因位点的表型各 异的遗传变异株，( 目前有很多拟南芥突变体库网页，如w w w b i o m e d c e n t r a l c o m ； m u t a n t 1 s e o k s t a t e e d u ；w w w r i f g p a c c n ；p m d d a b j n i g a c j p ) 。拟南芥的这一特性为 我们进行遗传研究提供了极大的便利。拟南芥的基因组很小，基因组中具有高度 重复、中度重复及低度重复d n a 的比例就低，这一特点对分子生物学家来说就意 味着可以比较容易地克隆和研究感兴趣的基因，特别是有关植物生长和发育的基 因。实验表明，在拟南芥基因组中，高度重复序列只占1 0 1 5 ，中度重复序列 只占7 ，5 左右，低度重复序列只占l 左右，而余下的近8 0 的d n a 基本上是用 来构建单拷贝基因的( 王年，2 0 0 1 ；k a u l ，2 0 0 0 ) 。由于在基因组中编码某一具特定 功能的产物的基因拷贝只有1 个，如果其中某个基因的产物参与了植物个体形态 发育过程，当该基因变异后，由于丧失的功能得不到额外拷贝基因的补偿，就会 导致很显著的植物个体形态变异。这也是为什么在人工诱变拟南芥种子后，可以 获得大量形态各异的、种类多样的和涉及植物发育各个过程的变异株。这些变异 株为研究各基因在植物发育中的功能及其调节提供了良好的材料，因此拟南芥也 被称为植物界研究的“果蝇”( 毛健民，2 0 0 1 ) 。 1 1 2 拟南芥作为植物研究的模式植物 植物与我们的生存息息相关，它提供给我们生存的氧气与食物，对我们的生活 有很大的重要性。植物生长发育的信息及与环境相作用的信息都是由它的基因组 来编码的。为了全面的了解植物我们需要读懂它们的这些遗传信息。在1 9 世纪8 0 年代时，重点是研究经济植物例如：棉花，花生及大豆，以期对植物的基础原理 进行全面的了解。要彻底全面的了解植物的生理及发育机理，困难是如此的巨大， 转向于一种模式植物的研究则可能成为一种捷径。 植物在进化过程中具有遗传保守性，因而，开花植物都有很近的亲缘关系，因 此对一种单一的，有代表性的植物材料的彻底研究，可为所有的高等植物研究提 供大量的研究信息。同时对模式植物蛋白功能的研究，也为高等植物蛋白的研究 提供了资料。在过去的几十年里，拟南芥作为一种模式植物被应用于这些领域内的 研究。尽管拟南芥不是一种经济作物，但由于其具有与大多数农作物相同的生长， 繁殖，对胁迫与虫害的反应机理，研究拟南芥的各种基因，了解其发育过程中或 上海师范大学删i 学位论文前高 在某种环境条件下基因的表达、调控，有助于进一步了解其它植物，并有助于在 理论上揭示物种的进化，而受到基础理论科学家的青睐。同时拟南芥利t 植方便经 济，并产生大量的种子，得到成千上万棵植株，可以进行大量的遗传实验研究。 而且拟南芥有相对较小的基因组，可以很便利的进行遗传分析。与其它植物相比， 拟南芥基因组中重复的，无功能的d n a 序列较少( 毛健民，2 0 0 1 ；康定明，2 0 0 1 ； k a u l ，2 0 0 0 ；m e i n k e ，19 9 8 ) 。 在拟南芥中的研究成果怎样应用于农作物的改良研究? 简单的说，当一个基因 在拟南芥中被克隆出来时，其它植物中的相应基因可能更容易被发现。拟南芥许 多基因是单拷贝的，易于操作，因此可以简单迅速地从它的基因组中克隆出所需 基因，再用它来作探针从有经济价值的植物中分离同源的基因。而且可以利用拟 南芥的许多基因是单拷贝的或小基因簇这一特点，对己找到的多基因或大基因簇 进行研究，这样比在其它植物中进行研究更容易、更直接。同时可能将拟南芥基 因组中与光合作用、呼吸代谢、贮藏物质合成、器官形态建成、干物质积累、抗 病抗逆等有关的基因逐一分离出来，再通过转基因技术转入到主要的农作物中和 经济植物中，从而获得巨大的经济效益。这样植物中许多重要的基因就可以通过 拟南芥中相应基因的研究来了解其功能。例如，从研究拟南芥抗病原体的机理中 得到的信息，可以直接用来培育抗病的农作物。拟南芥作为一种模式植物为全世 界的植物科学家提供更多的信息，也加速了植物界的研究。 1 1 3 拟南芥的研究 二十世纪八十年代后期，随着d n a 自动测序技术的发展，具有远见卓识的科 学家们认为，可以通过对人类基因组d n a 序列的破译来全面、深入、有效地研究 人类这一奇妙而复杂的生物体的奥秘。1 9 8 7 年美国国立卫生研究院f n i h ) 和美国能 源部( d o e ) 联合提出“人类基因组计划”，随后得到了美国政府的批准，并于1 9 9 0 年正式实施，此后成为包括我国在内的国际合作项目。其主要目标是测定人基因 组3 x t 0 9 b p 的全部序列，阐明全部基因的位置、结构、功能、表达调控方式，以及 重大疾病的致病机理。随着人类基因组计划的开展，许多模式生物的基因组计划 也相继展开。自1 9 9 5 年以来，先后完成的基因组全序列测定的生物有：流感噬血 杆菌( h a e m o p h i l u s i n f l u e n z a e ) 、酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 、线虫 ( c a e n o r h a b d i t 捃e l e g a n s ) 、果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 、拟南芥叫r a b i d o p s “ 上海师范大学硕士学位论文t i l l 舌 t h a l i a n a ) ( 黄娟，2 0 0 1 ) ( w w w t i g r o r g ) 。 表1 拟南芥基因组测序特征 t a b l e1 s u m m a r ys t a t i s t i c so f t h e a r a b i d o p s i sg e n o m e ( k a u l ，2 0 0 0 ) c h r 1c h r 2c h r 3c h r 4c h r 5t o t a l 长度( b p ) 2 9 ，1 0 5 ，1l11 9 ，6 4 6 ，9 4 52 3 ，1 7 2 ，6 1 71 7 ，5 4 9 ，8 6 72 5 ，9 5 3 ，4 0 9 11 5 ，4 0 9 ，9 4 9 上臂( b p )1 4 ，4 4 9 ，21 33 ，6 0 7 ，0 9 11 3 ，5 9 0 ，2 6 83 ，0 5 2 ，1 0 8 11 ，1 3 2 ，1 9 2 下臂( b p )1 4 ，6 5 5 ，8 9 81 6 ，0 3 9 ，8 5 49 ，5 8 2 ，3 4 91 4 ，4 9 7 ，7 5 9 1 4 ，8 0 3 ，2 1 7 总数3 3 43 553 5 43 5 53 45 罄雾 编码4 404 4 04 434 4 14 4 l 非编码3 2 43 2 93 303 2 83 25 基因数目6 ，5 4 34 ，0 3 65 ，2 2 03 ，8 2 55 ，8 7 42 5 ，4 9 8 基因密度( k b 基因) 4 04 94 54 64 4 基因平均长( b p )2 ，0 7 81 , 9 4 91 , 9 2 52 ，1 3 81 , 9 7 4 外数日3 54 8 21 9 6 3 12 6 5 7 02 0 0 7 33 i2 2 61 3 2 9 8 2 显 总长( b p ) 8 ，7 7 2 ，5 5 95 ，1 0 0 ，2 8 86 ，6 5 4 ，5 0 75 ，1 5 0 ，8 8 37 ，5 7 1 ，0 1 33 3 ，2 4 9 ，2 5 0 予每基因5 44 95 15 25 3 平均( b p ) 2 4 72 5 92 5 02 5 6 2 4 2 内数目 2 8 ，9 3 91 5 。5 9 52 1 ，3 5 01 6 ，2 4 82 5 ，3 5 21 0 7 ，4 8 4 含总长( b p ) 4 ，8 2 8 ，7 6 62 ，7 6 8 ，4 3 03 ，3 9 7 ，5 3 13 ，0 3 0 ，6 4 94 ，0 3 0 ，0 4 51 8 ，0 5 5 ，4 2 1 子平均( b p )1 6 81 7 71 5 91 8 6 1 5 9 有e s t 的基6 085 695 9 86 146 1 4 困的数目( ) e s t 数目3 0 , 5 2 21 4 ，9 8 92 0 ，7 3 21 6 ，6 0 52 2 ，8 8 51 0 5 ，7 3 3 功细胞代谢营1 ，1 8 86 2 07 4 55 8 88 6 84 ，0 0 9 转录8804 7 45 6 63 3 57 6 33 ，0 1 8 能植物防御6 4 02 7 63 5 42 9 54 9 02 ，0 5 5 信号5 7 32 9 63 5 62 1 04 2 0i ，8 5 5 归生长5 4 22 6 33 5 74 4 84 6 92 0 7 9 蛋白命运5 2 02 7 33 1 42 6 43 9 5l ，7 6 6 类胞问运输4 3 52 1 42 6 92 2 03 3 4l ，4 7 2 运输2 3 61 3 9 1 5 51 1 32 0 68 4 9 蛋白合成2 1 61 1 11 4 8 9 01 6 57 3 0 总计5 ，2 3 02 ，6 6 63 ，2 6 42 ，5 6 34 ，l1 01 7 ，8 3 3 1 9 9 0 年，由美国、欧洲、日本及澳大利亚的科学家成立的一项长期国际合作 拟南芥基因组研究计划( t h em u l t i n a t i o n a lc o o r d i n a t e da r a b i d o p s i st h a l i a n ag e n o m e r e s e a r c hp r o j e c t ) ，从分子水平上对开花植物的生理，生化，生长及发育机理进行 研究，内容包括对遗传上与生理上的基因进行鉴定，分离，测序与研究，其最终 目的是在2 0 0 0 年底把拟南芥的全部的基因序列测序完成。1 9 9 6 年大规模的的拟南 芥基因组测序计划正式拉开了序幕，科学家们经过了3 年的努力，终于在1 9 9 9 年 上海师范大学硕士学位论文前言 1 2 月的英国自然杂志上，公布了拟南芥2 号、4 号染色体的测序结果。在2 0 0 0 年1 2 月1 4 日英国出版的n a t u r e 杂志上( v 0 1 4 0 8 ：7 9 6 8 1 5 ) ，发表了拟南芥 1 1 5 4 m b 的全序列图谱。拟南芥d n a 全长1 2 5 m b ，只剩下1 0 m b 的中心着丝区d n a ， 因为多重复序列所含基因很少，还未全测出。拟南芥全基因组d n a 包含2 54 9 8 个 功能基因组及其所对应的1 10 0 0 个蛋白质家族。这是人类首次全部破译出一种高 等植物的全基因序列，是在分子水平上向植物生命奥秘探索的又一里程碑式的工 作( 康定明，2 0 0 1 ；k a u l ，2 0 0 0 ；m e i n k e ，1 9 9 8 ；l i n ，1 9 9 9 ；m a y e r ，1 9 9 9 ；t h e o l o g i s ，2 0 0 0 ； s a l a n o u b a t ，2 0 0 0 ；t a b a t a ，2 0 0 0 ) ( 表1 ) 。 拟南芬基因组全序列测定完成后，在拟南芥基因组中大约有2 5 0 0 0 个基因，其 中只有很少的部分基因知道了功能，大部分基因的功能还是未知的。科学的研 究进入了后基因组时代，为了研究这些基因在细胞、器官及进化过程中的作用， 2 0 0 0 年1 月1 3 1 4 号又提出了国际拟南芥功能基因组计划( f r e d e r i c k ，2 0 0 2 ) ，目标是 要在1 0 年时间内把拟南芥中的2 5 0 0 0 个基因的功能全部了解清楚( f r e d e r i c k ，2 0 0 2 ； 科技政策与发展战略，2 0 0 1 ；t h em u l t i n a t i o n a l a r a b i d o p s i ss t e e r i n gc o m m i t t e e ， 2 0 0 2 ) 。其计划内容如表2 ： 1 2 花药发育 花是植物的一个主要生殖器官，一朵典型的植物花朵主要包括四个组成部分： 花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊。雄蕊是花中的一个重要的组成部分，显花植物中的雄 性生殖过程是在雄蕊中发生的。这一过程包括二倍体的细胞经减数分裂生成单倍 体的雄配子：小孢子；小孢子经有丝分裂形成多核的含精细胞的花粉粒。花药及 花粉的发育是植物发育生物学中的一个重要研究领域。 上海师范入学硕士学位论文 前言 表2 拟南芥功能基因组计划 t a b l e 2 t h em u l t i n a t i o n a lc o o r d i n a t e d a r a b i d o p s i s t h a l i a n af u n c t i o n a lg e n o m i c s 卜3 年的目标 开发必要的基因工具，包括： 综合性地标识出顺序的突变体集合，通过数据库检索可获得 全部基因组图谱和基因表达d n a 芯片 有条件的基因简易表达系统 生产抵御疾病的抗体，描述机体中完整的蛋白质剖析图，各种环境条件下的细胞和 亚细胞状态 3 - 6 年的目标 建立完整的全长c 蜊a 资料库 构建相连、重复基因的特定缺失 开发引导突变体和特定部位重组的方法 描绘机体中完整的m r n a 表达图，各种环境条件下的细胞、亚细胞状态 扩展对遗传翻译后的诱发变异的总体认识 描绘机体中完整的代谢图，查明各种环境条件下的细胞、亚细胞状态 1 0 年的目标 植物人工染色体 确定全部基因的顺向调整顺序 查明每种复制因子控制的调整途径 查明每种蛋白质的生物化学功能 描绘每种植物特有的蛋白质家族成分的三维结构 对离子和代谢物的提取、运输和贮藏进行系统分折 全面描述机体中的蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸、蛋白质与其他物质的相互作 用、以及各种环境条件下的细胞和亚细胞状态 测定基因组的排序和专门采自生叶茎节种的e s t 样品 确定保护基因功能多样化的有预见性的基本准则 比较物种内的基因组序列 研究生物信息科学、形象化的手段和模型制造工具，以方便地使用有关 的典型虚拟植物的所有生物学信息 上海师范大学硕士学位论文 1 2 1 花药发育的一般原理 雄蕊主要有两部分组成：花丝和花药。花丝是中空的管状结构，作用是固定 雄蕊并作为水分与养料的运输管道。花药是雄蕊中最重要的组成部分，含有与花 粉粒形成及释放相关的生殖与非生殖组织，从而保证传粉与受精过程的顺利完成。 花药的发育可以分为两个过程：第一个过程是花药的形态建成，在这一过程中细 胞与组织发生分化，小孢子母细胞进行减数分裂。在第一个过程结束时，花药中 含有大量的特异性的细胞与组织，并且小孢子四分体包裹在花粉囊中：第二个过 程是细胞的衰退与凋亡阶段，在这一过程中花粉粒发生分化，花药膨大并被花丝 托到合适的位置，组织发生衰退开裂，花粉囊破裂，花粉粒释放( g o l d b e r g ，1 9 9 3 ) 。 f i g u r e 1ag e n e r a l i z e do v e r v i e wo f a n t h e rd e v e l o p m e n t ( s a n d e r s ，1 9 9 9 ) 按照细胞类型的不同，花药发育的这两个过程又可以分为1 4 个步骤( s a n d e r s ， 1 9 9 9 ) 。在每一步骤中发生的主要事件及花药的形状如表3 与图2 所示： 7 上海师范大学硕士学位论文前言 表3 花药发育的主要事件 t a b l e 3m a j o re v e n t sd u r i n g a r a b i d o p s i sa n t h e rd e v e l o p m e n t ( g o l d b e r g ，1 9 9 3 ) 花药时期主要事件存在的组织花期花粉粒期 花原基出现 l 2 层四个角隔处分化出孢子细胞 原基细胞变为卵圆形 由孢子细胞分化为初级母细胞与 初级造孢细胞，进一步分化为二级母细胞 花药呈四角形，维管束细胞开始分化 花药形态建成，四个角隔分隔明显 小孢子母细胞开始分化 l l ，l 2 ，l 3 5 表皮。孢子细胞 表皮，2 层母细胞 7 l 层造孢细胞 e ，e n ，m l ，t ，v c 8 e ，e n ，m l ，t ，、c 93 m c 小孢子母细胞减数分裂形成花粉母细胞，中间e , e n , m l , t , v , c 层开始衰退，绒造层内出现空泡，花药体积变大m c4 减数分裂完成，四分体结构形成， 残存中间层细胞 胼质层壁破裂 ，j 、孢子释放出来 花药继续扩大，j 、孢产生外壁并且小孢 内出现空泡，在电镜下可观察到隔膜细胞 e ，e n ，m l ，t ，v c t d s e ，e n ，t v c ，m s p 1 0 e ，e n ，t ，、c ，m s p s m 绒毡层细胞开始衰退 e ，e n ，t v c 。m s p ，s m 花粉粒开始有丝分裂，绒毡层降解，药室内壁与e ，e n ，t , v , c s m 连接层细胞开始纤维增厚，s m 开始衰退，s t 层开始分化 s t 花粉粒呈三层，隔膜细胞开裂，花药分为两个药室e ，e n ，p g v c ，s t 花药在裂缝处开裂，花粉粒释放e ，e n ，p g ，v , c 雄蕊开始衰老，细胞与花药结构收缩e ，e n ，、c 雄蕊从衰老的花中脱落下来 5 6 - 7 1 1 。1 2 8 9 l o 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 2 3 4 5 6 7 8 9 m 他”h 协 上海师范大学硕士学位论文 f i g u r e 2p h a s eo f w i l d - t y p e a r a b i d o p s i st h a l i a n aa n t h e rd e v e l o p m e n t ( g o l d b e r g ，1 9 9 3 ) 9 上海师范大学硕上学位论文前言 花粉的发育： 雄蕊原基由花的分生组织特异性位点上的一轮小的突起处形成的。不同植物 中的雄蕊原基数目是不同的，但它们在花分生组织中的位置是固定的，都是位于 花分生组织的第三轮。雄蕊原基是在萼片原基和花瓣原基出现以后，心皮原基出 现以前发生的。雄蕊原基出现以后，花药与花丝发生分化，花药成为双边，对称 的蝴蝶模型。雄蕊原基的发生并不依赖于萼片与花瓣原基的形成。 花粉粒的发育是由二倍体的小孢子母细胞经过二次减数分裂形成4 个单倍体 的小孢子( 四分体) ，共同包含在一个胼胝质中，由绒毡层合成的胼胝酶消化胼胝 质壁，释放单个的小孢子。然后小孢子经过不平衡的有丝分裂形成一个大的营养 核，及一个小的生殖核的双核花粉粒，生殖核再进行一次有丝分裂形成三核花粉 粒( 图3 ) ( s a n d e r s 1 9 9 9 ) 。 f i g u r e - 3s c h e m a t i co f m i c r o s p o r o g e n e s i st y p i c a lo f m o s ta n g i o s p e r m s ( s a n d e r s ，1 9 9 9 ) 1 0 上海师范大学硕上学位论文前言 1 2 2 植物雄性不育 植物雄性生殖器官不能产生正常功能的雄配子一花粉的现象称为雄性不育。迄 今已在4 3 个科1 6 2 个属6 1 7 个物种中发现雄性不育( 陈明，2 0 0 3 ) 。雄性不育有遗传 的和不遗传的两种类型。遗传的雄性不育现象是由染色体和基因控制，也有的是 基因与环境互作的结果，可以通过亲代到子代一代代遗传下去。不遗传的雄性不 育是由不良环境造成的，如高温、低温、干旱、冻害、营养不良等使植株的某种 功能失调而造成雄性不育，这种不育特性不能代代相传。 根据它们的作用机理可以把雄性不育分为核不育( n m s ) 、胞质不育( c m s ) j l 1 生理不育( 指应用物理或化学方法诱导的雄性不育) 三种类型。核不育主要是受 核基因控制的，又可分为隐性单基因雄性不育、隐性多基因雄性不育和显性单基 因雄性不育三种类型。胞质不育指的是自然界存在一些特殊的不育细胞质，当核 基因组缺乏抑制其表型的恢复基因时，植株表现为雄性不育，反之，在存在恢复 基因的核背景下则雄性可育，即c m s 是细胞质基因和核基因互作的结果。生理型 雄性不育主要是由环境条件、物理的或化学方法诱导的不育。 雄性不育对植株本身来说是一种不利性状，但在自然界中也是植物在进化过 程中一种生存的方式。一种植株因自身原因雄性不育，而它的雌性是正常的，只 有接受外来花粉，才能受精结实，产生杂种，杂种在生长势和适应性方面具有强 大优势，人们利用这一现象提高农作物的产量、质量和抗性。植物雄性不育是植 物杂种优势利用的工具，具有重要的生产利用价值，同时，植物雄性不育特性既 有核基因控制，又有核外细胞质基因控制，表现为核质互作的遗传现象，雄性不 育是研究植物的线粒体遗传、叶绿体遗传和核质互作遗传现象的极好材料，可以 把性状遗传、细胞遗传和分子遗传相结合进行研究，同时雄性不育与育性基因的 表达有密切关系，可以作为突变体进行植物发育生物学研究，研究育性基因的表 达调控，因此植物雄性不育研究是近年来植物遗传学研究的一个热点( 朱英国， 2 0 0 0 ) 。 上海师范大学硕士学位论文 刚舌 1 2 2 1 植物雄性不育的表型特征 雄性不育主要是植物雄性器官异常，其表型特征表现为多种形式( 朱英国， 2 0 0 0 ) 。 ( 1 ) 雄性器官萎缩、畸形、消失或雄性器官雌性化。 ( 2 ) 不能形成正常的小孢子或无花粉，这种雄性不育败育发生在小 孢子母细脆和减数分裂期。 ( 3 ) 小孢子发生异常，形成不完善的、不能存活的、畸形的和败育的花粉。 ( 4 ) 花粉不能成熟或无萌发能力。 ( 5 ) 花粉有一定的生活力，但花药不开裂。 ( 6 ) 花粉在柱头上不萌发，不能识别。 1 2 2 2 植物雄性不育的类型 k a u l ( 1 9 8 8 ) 根据植物雄性不育表型特征将植物雄性不育分为三种类型： ( 1 ) 结构性雄性不育。雄性器官结构显著异常，致使小孢子组织不能发育， 不能生成小孢子，雌性性器官正常。 ( 2 ) 孢子发生性雄性不育。植物花药中雄蕊能正常发育，但小孢子发生或雄 配子发生出现缺陷，使得花粉不能产生或花粉异常、畸形、无花粉，这类 雄性不育主要发生在减数分裂前后或减数分裂不正常或减数分裂后有丝分 裂不正常。 ( 3 ) 功能性雄性不育。雄性配子功能异常，这种类型雄性不育雄性器官能形 成正常的花粉，但由于多种障碍，花粉不能与雌性生殖器官受精，而不能 结实，这种障碍如花药发育不开裂、花粉外壁发育不全或不具外壁、花粉 不能在柱头上萌发、花粉管生长不正常、不能受精等。 1 2 3 拟南芥雄性不育基因 。 在花粉的发育过程中有大量的基因表达，据估计仅特异性表达的基因就有 3 5 0 0 个z 右( s a n d e r s ，1 9 9 9 ) ，而其中6 0 1 0 0 个基因为花粉发育所必需的，这其中任 何一个基因的突变都会导致雄性不育( w i l s o n ，2 0 m ) 。目前已经报道的拟南芥雄性 不育基因有二十多个。表4 列出到目前为止所有已被克隆的拟南芥中的雄性不育 上海帅范大学硕十学位论文 日i j 舌 基凼。 按照基因的功能，这些基因大体上可以分为以下几类：第一类与茉莉酮酸合 成有关：茉莉酮酸是植物体内广泛存在的一类生长调节物质，与花药开裂、果实 成熟、根的生长以及植物对昆虫和病原体的抵抗有关( c r e e l m a n ，1 9 9 7 ) 。f a d 3 、f a d 7 及f a d 8 三个基因一起突变( m c c o n n ，1 9 9 6 ) ，以及d a d l 基因( i s h i g u r o ，2 0 0 1 _ ) 、 o p r 3 d d e l 基因( s a n d e r s ，2 0 0 0 ；s t i n t z i ，2 0 0 0 ) 、a o s 基因的突变都会引起拟南芥植 株花药开裂推迟而导致雄性不育( p a r k ，2 0 0 2 ) 。当用茉莉酮酸( j a s m o n i ca c i d ) 处理 这些雄性不育突变体时，这些突变体又恢复育性。通过这些突变体及其相应基因 的克隆，阐明了拟南芥体内茉莉酮酸这一植物重要的信号分子在体内的合成途径。 第二类雄性不育基因与转录因子有关：m s l 突变体是最早见于文献报道的拟南芥 雄性不育突变体。m s l 基因( a t 5 9 2 2 2 6 0 ) 的克隆及序列分析表明，该基因具有 p h d f i n g e r 结构域( p h d f i n g e rm o t i f ) 。在许多生物体中都发现具有p h d f i n g e r 结构域的蛋i ! i ( y a n g ，2 0 0 3 ) ，尽管他们的作用不同，但都参与转录调节作用，因此 推测m s l 基因在花药发育过程中起转录调节作用( w i l s o n ，2 0 0 1 ) ，而n o z z s p l 基 因( a t 4 9 2 0 9 0 0 ) 编码的蛋白质与具有m a d s 盒( m a d sb o x ) 的转录因子相关( y a n g ， 1 9 9 9 ；g l o v e r ，1 9 9 8 ；s c h i e f l h a l e r , 1 9 9 9 ) 。a m s 编码m y c 类转录因子( s o r e n s e n ， 2 0 0 3 ) 。a t m y b 2 6 是一类r 2 r 3 - m y b 转录因子，与花药的开裂相关( s a b i n e ，2 0 0 3 ) 。 这些结果表明小孢子发育过程中转录调节作用基因的突变会导致雄性不育。第三 类与花粉形成过程中减数分裂相关，包括s y n l ( b a i ，1 9 9 9 ) 、a s k l ( y a n g ，1 9 9 9 ) 及 m s 5 p o l l e n l e s s 3 ( g l o v e r , 1 9 9 8 ；s a n d e r s ，1 9 9 9 ) 。除这三类雄性不育基因外，还有其他 一些雄性不育基因如e m s l ( a t 5 9 0 7 2 8 0 ) 基因编码l r r - r p k ( 1 e u c i n e r i c hr e p e a t r e c e p t o rp r o t e i nk i n a s e ) 。e m s l 突变体中，产生大量的小孢子母细胞，而缺少绒毡 层细胞，表明该基因参与控制花药中体细胞和生殖细胞的命运( z h a o ，2 0 0 2 ) 。a p t l 基因编码腺嘌呤磷酸核糖基转移酶( a d e n i n e p h o s p h o r i b o s y lt r a n s f e r a s e ) ，该基因突 变体生长缓慢，减数分裂后小孢子发育异常导致雄性不育( g m l l a r d ，1 9 9 8 ) 。m s 2 基 因控制花粉壁的形成，该基因的突变可能因花粉和柱头不能识别而导致不育( a a r t s ， 1 9 9 3 ) 。 上海师范大学硕士学位论文 表4 拟南芥中的雄性不育基因 t a b l e 4t h em s g e n eo f a r a b i d o p s i s 突变体基因数据库中代码基因特性( 作用)参考文献 f a d 3 f a d 7 f a d s d a d i a o s o p r 3 d d e i m s l n o z z l e s p l s y n l a s k l m s 5 p o l l e n l e s s 3 e m s l m s 2 a p t l a 心d y b 2 6 a m s m m d l a t 2 9 2 9 9 8 0 与f a d 7 f a d 8 一起突变 a t 3 9 l l l 7 0与f a d 3 f a d 8 一起突变 a t 5 9 0 5 5 8 0荣莉酮酸合成m c c o n n a n db r o w s e 1 9 9 6 a t 2 9 4 4 8 1 0茉莉酮酸台成i s h i g u r oe ta 1 。2 0 0 1 a t 5 9 4 2 6 5 0茉莉酮酸合成p a r k e ta 1 2 0 0 2 a t 2 9 0 6 0 5 0茉莉酮酸合成s a n d e r se ta 1 2 0 0 0 ； s t i n t z ia n db r o w s e ，2 0 0 0 a t 5 9 2 2 2 6 0p h d f i n g e rm o t i f w i