药物分析技术及进展(175557).doc

药物分析技术及进展色谱联用技术（hyphenated techniques in chromatography，HTC）是将具有高分离效能的色谱技术与能够获得丰富化学结构信息的光谱技术相结合的现代分析技术。目前，各种色谱联用技术在药品质量研究工作中发挥着重要作用。色谱作为分离手段，光谱充当鉴定工具，两者取长补短，已成为当今分析领域中复杂成分样品分析的主要方法。例如，气相色谱-质谱联用（GC-MS）、高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）、高效液相色谱核磁共振波谱联用（HPLC-NMR）、气相色谱-傅立叶变换红外光谱联用（GC-FTIR）、以及毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）等。本章围绕几种应用较广泛的色谱联用技术及其在药物分析中的应用予以简述。一、气相色谱-质谱联用技术气相色谱与有机质谱的联用系统（GC-MS）是最早实现（1957年）的联用仪。70年代，GC-MS已开始作为商品出售；80年代，已开始普及应用；迄今技术日臻成熟，广泛应用于医药卫生、石油化工、环境保护和生命科学等领域。目前气-质联用在联用技术应用中十分活跃，它的成功应用能使样品的分离、鉴定和定量一次完成，毛细管气相色谱与质谱联用的检测限已达109g1012g水平。对于药物分析的发展也起到了很大的促进作用，例如GC-MS在合成产物的确证，有机合成反应中副产物的鉴定，中药未知成分的鉴定，药物代谢物的研究等方面均是最重要的工具之一。 该方法利用了质谱仪扫描快、灵敏度高的特点，而且用电子轰击离子源（EI）所获得的质谱，碎片信息量大，重复性好。因此GC-MS联用仪多具有10万或几十万张质谱的数据库，以供比对定性。气相色谱仪可以看作是质谱仪的进样系统，相反也可以把质谱仪看作是色谱仪的检测器。因质谱仪灵敏度高、特征性强、要求分析试样必需是高度纯净物（除MS-MS联用技术外），色谱技术为质谱分析提供了色谱纯化的试样，质谱仪则提供准确的结构信息。虽然GC-MS联用仪是最成熟的联用装置，但由于受样品的挥发性限制或极性的影响，分析前常常需要衍生化处理后再分析，因此使用范围不如LC-MS广泛。但在其分析范围内该法具有高分辨能力和高灵敏度，仍然是分析工作者经常选择的方法。定量分析常用的测定方法为总离子流法（TIC法）、选择离子监测法（SIM法）和选择反应监测法（SRM法）。（二）接口GC-MS仪的接口组件是解决气相色谱和质谱联用的关键组件，它起传输试样，匹配两者工作流量（也就是工作气压）的作用。理想的接口应能去除全部载气而使试样毫无损失地从气相色谱仪传输给质谱仪。要求试样传输产率高，浓缩系数大，延时短，色谱的峰展宽少。一般接口可以分为三类：直接导入型、分流型和浓缩型。最简单的、也是目前最常用的一种接口是毛细管柱直接导入型接口。这种接口是将毛细管色谱柱的末端直接插入质谱仪离子源内，柱的流出物直接进入电离盒区，然后被离子源高真空泵组排入大气。接口只起保护插入段毛细管柱和控制温度的作用。这种接口的优点是构造简单和产率高（100%），缺点是无浓缩作用，不适合流量大于1mlatm/min的大口径的毛细管柱和填充柱。（三）质谱仪由气相色谱仪通过接口进入质谱仪离子源的气态分子电离后，不同质荷比的离子被质量分析器分离，由检测器检测、显示和存入计算机中。要实现GC-MS联用，需要解决两个关键问题，一是GC的出口为常压和MS的真空操作条件相互匹配问题，二是检测速度问题，要求在色谱峰出峰时间内完成质谱鉴定（在测定质量范围内完成质谱扫描）。前者由接口技术解决，后者由快速扫描质谱仪来解决。在GC-MS联用中最常见的是四极杆质谱仪，其扫描速度快、离子源真空度要求低、结构简单、价格低廉，适用于一般有机样品的分析。（四）计算机GC-MS联用仪中的计算机也被成为化学工作站，它能实现在线数据处理、仪器控制和自动化管理；能记录和存储色谱图及质谱图，并进行各种运算、定量分析、创建谱库或从购买的谱库中检索谱图进行样品组分的鉴别等。目前通用的标准谱库有：NIST库（美国国家科学技术研究所出版）；NBS库；Willey库（Willey公司出版）等。这些质谱库内贮存了各类有机物分子的标准质谱图和相应的结构式，并且经常更新。专用谱库有：Pfleger药物库；TX毒物库；EI农药库；挥发油库等。液相色谱-质谱联用技术高效液相色谱-质谱（HPLC-MS，简称LC-MS）联用技术是90年代发展成熟的分析技术，它集HPLC的高分离能力与MS的高灵敏度、极强的结构解析能力、高度的专属性和通用性、分析速度快于一体，已成为药品质量控制（包括药物中微量杂质、降解产物、药物生物转化产物的分析鉴定）、药用植物成分分析、体内药物和药物代谢研究中其它方法所不能取代的有效工具。HPLC法可以分离的化合物范围远较GC法为大，与GC-MS联用技术相比较，GC法对样品的极性和热稳定性有一定要求，因此在GC-MS联用技术分析前，样品的预处理极为重要。LC-MS联用分析前样品预处理简单，一般不要求水解或者衍生化，可以直接用于药物及其代谢物的同时分离和鉴定。但是LC-MS仍存在明显不足，主要为：由于离子化问题，对部分化学成分的响应差，不能分析所有结构类型的化合物；对色谱流动相的组成有限制，不宜使用非挥发性缓冲盐，挥发性缓冲盐的浓度也应控制在10mmol/L以下，在一定程度上降低了LC-MS的应用范围；所提供的化学结构信息尚不足以彻底解决化合物的鉴定问题，尤其对阐明化合物的基团连接位置和立体构型等缺乏证据。随着科学技术的不断进步，LC-MS技术还可能得到进一步发展。 LC-MS技术集液相色谱的高分离能力与质谱的高灵敏度和极强的定性、专属性于一体，成为其他方法所不能取代的有效分析工具，其主要优点如下：（1）样品适用范围宽。一般不要求水解或者衍生化处理，即可直接用于检测强极性化合物，如结合型代谢产物。LC-MS可测定的相对分子质量范围很宽，一般为m/z 502000，有的仪器可达m/z 506000，而且能够检测多种结构的化合物；（2）检测灵敏度高。能够对复杂基质中痕量的组分进行定性和定量分析；（3）可提供结构信息。通过软电离方式，一级质谱中的准分子离子峰和加合离子峰可以给出分子量信息；利用碰撞诱导裂解能够进行多级质谱分析，可提供丰富的化学结构信息。常用的接口装置有以下几种：（一）电喷雾接口带有供试品的色谱流动相通过一个带有数千伏高压的针尖喷口喷出，生成带电液滴，经干燥气除去溶剂后，带电离子通过毛细管或者小孔直接进入质量分析器。传统的电喷雾接口只适用于流动相流速为1-5l/min的体系，因此电喷雾接口主要适用于微柱液相色谱。同时由于离子可以带多电荷，使得高分子物质的质荷比落入大多数四级杆或磁质量分析器的分析范围（质荷比小于4000），从而可分析分子量高达几十万的物质。（二）热喷雾接口存在于挥发性缓冲液流动相（如乙酸铵溶液）中的待测物，由细径管导入离子源，同时加热，溶剂在细径管中除去，待测物进入气相。其中性分子可以通过与气相中的缓冲液离子（如NH4+）反应，以化学电离的方式离子化，再被导入质量分析器。热喷雾接口适用的液体流量可达2ml/min，并适合于含有大量水的流动相，可用于测定各种极性化合物。由于在溶剂挥发时需要利用较高温度加热，因此待测物有可能受热分解。（三）离子喷雾接口在电喷雾接口基础上，利用气体辅助进行喷雾，可提高流动相流速达到0.1ml/min。电喷雾和离子喷雾技术中使用的流动相体系含有的缓冲液必须是挥发性的。（四）粒子束接口将色谱流出物转化为气溶胶，在脱溶剂室中先脱去溶剂，得到的中性待测物分子导入离子源，使用电子轰击或者化学电离的方式将其离子化，获得的质谱为经典的电子轰击电离或者化学电离质谱图，其中前者含有丰富的供试品分子结构信息。但粒子束接口对供试品的极性、热稳定性和分子质量有一定限制，最适用于分子量在1000以下的有机小分子测定。（五）解吸附技术将微柱液相色谱与粒子诱导解吸技术（快原子轰击和液相二次粒子质谱）结合，一般使用的流速在1-10l/min之间，流动相须加入微量难挥发液体（如甘油）。混合液体通过一根毛细管流到置于离子源中的金属靶上，经溶剂挥发后形成的液膜被高能原子或者离子轰击而离子化。得到的质谱图与快原子轰击（或液相二次离子质谱）的质谱图类似，但是本底却大大降低。二、中药中掺入化学药物的分析方法研究药品是防病、治病和康复保健的特殊商品。中成药作用缓和，不良反应小，深得患者的喜爱。但我国市场上出现了非法掺入化学药物的违法行为。为确保中药制剂质量，保障临床用药安全，研究灵敏、快速、准确的分析方法，以利于加大检测力度，有效打击此类药品掺假造假的不法行为。采用TLC法初篩，高效液相色谱-光二极管阵列检测器(HPLC-DAD)、LC-MS 或超高效液相色谱-二级质谱(UPLC-MS/MS) 法等多种液相色谱技术与方法可确证中药制剂中非法掺入的化学药物。示例 液相色谱-质谱联用法检测中药制剂及保健食品中非法添加的16种镇静催眠药物1.仪器 Finnigan LCQ Advantage液相色谱-离子阱质谱联用仪（配有ESI源）、Surveyor高效液相色谱仪（配有液相泵、自动进样器及二极管阵列检测器）均为美国热电公司产品。2.色谱条件 Waters Sunfire C18色谱柱（150 mm4.6 mm，5m）；流动相A：20 mmol/L醋酸铵溶液，流动相B：甲醇；梯度洗脱：08 min，B相为50%；815 min，B相由50%55%；1520 min，B相由55%60%；2025 min，B相由60%75%；2530 min，B相回到初始比例50%；检测波长为230 nm；流速为1 ml/min；进样量20 l。3.质谱条件 电喷雾离子源（ESI），源电压4.5 kV；毛细管温度270 ；毛细管电压20V；鞘气流速50 arb。正负离子检测，扫描方式采用全扫描一级质谱、全扫描二级质谱（MS/MS），相对碰撞能量35%，质量数范围1001000。4.对照品和供试品溶液的制备 （1）对照品溶液制备：精密称取巴比妥对照品200 mg，扎来普隆、硝西泮、艾司唑仑、三唑仑、奥沙西泮对照品各25 mg，地西泮、氯氮平对照品各20 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；精密量取5 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。（2）对照品溶液制备：精密称取异戊巴比妥、司可巴比妥钠对照品200 mg，阿普唑仑、马来酸咪达唑仑对照品各20 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；精密量取5 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。（3）对照品溶液制备：精密称取苯巴比妥对照品200 mg，氯硝西泮、劳拉西泮和氯氮卓对照品各25 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；精密量取5 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。（4）供试品溶液的制备：取两倍服用量样品，研细，置25 ml量瓶中，加甲醇20 ml，固体制剂超声15 min，液体制剂振摇2 min，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。三、近红外光谱(NIRS)快检技术近红外光谱（near-infrared spectrophotometry，NIRS）是一种用于鉴定有机物质十分有用的技术。近红外光谱是中红外光谱（mid-infrared spectrum，MIRS；2500nm25000nm）中C-H，N-H，O-H和S-H的共振吸收，具有高信息量。波长范围为780nm2526nm（12820cm-13959cm-1），而且该光谱取决于粒子大小、多晶型、残留溶剂、湿度等等因素，因此待测物光谱的鉴定不可能直接与参比物质光谱比较后确定，常常需要将所得数据经合适有效的数学处理后方能进行。近红外光谱技术具有操作简便、分析速度快、无需耗损样品和化学试剂，及易于实现现场分析等特点。随着计算机技术的不断发展，在药物分析领域得到愈益广泛的应用。药品快速检验技术是运用在药品检验上一项新的技术,这一新技术的研究和发展对于及时发现假劣药品发挥着重要的作用.运用快检技术是现场检查中提供发现假劣药品的初筛手段和方法,同时对可疑药品进行暂控,大大缩短了抽检周期.同时也节省了资源,提高了监督抽验的阳性率,而且可以防止假劣药品的转移和流失,有效的打击不法分子,为广大人民群众用药安全有效做出很大贡献,进一步净化了我们的药品市场。中国药品生物制品检定所建立了近红外药品鉴别系统，SFDA_Ident软件是为车载NIR仪编写的中文软件，是车载NIR仪的操作平台，OPUS软件在后台运行。SFDA_Ident软件可以对药品进行定性、定量分析，包括药品检验、程序设置和仪器常规检测三方面内容。t 药品检测车及其作用药品快速检测系统以车为载体，将近红外无损伤检测技术、经典化学分析技术及现代计算机信息技术等融于一体，在监管现场进行快速筛查，锁定可疑药品，增强震慑力，使假劣药品无藏身之处。在药品检测车中配备了近红外检测仪，各种化学快速鉴别仪，便携计算机等设备，装备了由近红外快速鉴别技术、化学快速鉴别技术、中药材快速鉴别技术、药品信息查询技术等，具有操作