园艺植物组织培养技术.doc

植物组织培养农学函授专用 计划学时：2学时 属累计学时：1-2学时教学目的：让学生了解组织培养的概念、类型及发展简史。教学重点：组织培养、外植体、细胞学说、细胞全能性的概念，组培的条件，组织培养的类型教学难点：组织培养、外植体、细胞学说、细胞全能性的概念教学方法：理论讲解教学过程： A 组织教学 B 讲授新课第一章 绪 论第一节 植物组织培养的基本概念 植物组织培养是本世纪初开始，以植物生理学为基础发展起来的一项技术。本书所指植物组织培养具有广泛的含义。即应用无菌操作方法，培养植物的一个离体器官、组织或细胞。经各国科学家80多年的辛勤探索，现在可以说几乎所有的植物，其器官、组织或细胞都能离体培养成功。大多数还能从细胞的一部分，甚至没有细胞壁的裸露的原生质体中，再生出无数的小植株。这项技术已非常成熟，并取得了巨大的经济效益，在生物学理论探讨和生产实践上已经取得了卓越的成就。植物组织培养是生物技术的一个工作平台，近几年来由于转基因技术取得巨大成功，边境证基因植物的组织培养上了一个新的台阶。一、 植物组织培养的概念指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。进行组培的条件：1、无菌：指培养基、接种工具、外植体、接种环境等处于无真菌、细菌、病毒等微生物的环境。措施：利用超净工作台接种（原理是空气过滤）、用高压蒸汽灭菌处理培养基和接种器械、用消毒灭菌剂浸泡外植体、用消毒液喷雾和紫外线照射接种室和培养室等。2、人工控制的环境：指对光照、温度、湿度、气体等条件进行人工控制。3、培养基；由水、无机盐类、有机营养成分、激素、天然物质、PH、琼脂等构成。需经过高压灭菌才能使用。4、外植体：用于离体培养的植物材料，包括植物器官、组织、细胞及原生质体等。二、植物组织培养的类型根据外植体的不同，分为：1、 组织培养：常用分生组织、形成层组织、薄壁组织、韧皮部组织等。2、 器官培养：常用根、茎、叶、花、果实、种子等。3、 胚胎培养：常用幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房等。4、 细胞培养；用单个或较小有细胞团培养，常用性细胞、叶肉细胞、根尖细胞等。5、原生质体培养：就是用特殊方法脱去植物细胞壁，对裸露的有生活力的原生质团进行离体培养。植物原生质体培养和细胞融合是植物细胞工程的核心技术。它克服了植物远缘杂交的不亲和性，是品种改良和创造育种亲本资源的途径。第二节 植物组织培养的发展简史用插条的方式繁殖蔷薇花，以及切开马铃薯的块茎进行种植的方法，早在人们把它作为学问研究之前就实际用于花卉及部分栽培作物的营养繁殖了。而在十九世纪开始，细胞学说的开创与发展，对植物激素的研究和深入，微生物培养法等各个领域的知识的汇集才导致了今日植物组织培养的发展。植物组织培养是本世纪初开始，以植物生理学为基础发展起来的一项技术，经历了探索和开创、奠基、蓬勃发展三个时期。一.探索和开创时期（1）细胞学说的提出：18381839年Schwann和Schleiden创立了细胞学说，他们认为植物和动物都是由细胞构成的，细胞是有生命的有机体，细胞进行分裂而增多，并组建成生物体。（2）细胞全能性建立：在此理论的推动下，1898年德国植物学家GHaberlandt设计用实验方法来检验细胞学说，于1902年发表了植物细胞培养的第一篇论文，认为可以培养植物的体细胞成为人工胚。他提出植物细胞具有全能性（totipotent）的设想，即每个细胞都具有原植物的全部遗传性，都与受精卵细胞一样，具有发育成一个完整植株的潜能。为了证明这个理论，他进行了人工培养小野芝麻、凤眼兰的叶肉组织、万年表属植物的表皮细胞等实验，虽然由于当时技术水平有限，培养没有成功，但细胞全能性理论对植物组织培养发展起到了先导作用，在技术上也是个良好的开端。1904年，E.Hanning培养了萝卜和辣根菜属的一种植物的近成熟胚，发现能使胚发育成熟。1908年，S.S imon在白杨嫩茎的培养中，观察到愈伤组织的发生和根、芽的形成。1922年，美国的Robbins和德国的Kotte分别报道获得了豌豆和玉米根尖离体培养的成功。1925年Laibach将亚麻种间杂交不能成活的胚取出培养，使杂种胚成熟，继而荫发。二、奠基时期20世纪30年代初到50年代末，是植物组织培养的发展时期。当时以法国的RJGautheret和美国的PRWhite为首的科学家形成了两个植物组织培养研究中心，工作取得巨大进展。30年代最主要的发现有三点：一是植物激素生长素的应用；二是B族维生素对植物细胞生长的重要性被认识，并被普遍采用；三是由Cautheret和White所发展的基本方法。这三者奠定了以后各种植物组织培养的技术基础。1934年，荷兰植物学家F.W.Went发现了生长素，即吲哚乙酸。随后不少学者又相继发现吲哚丁酸、萘乙酸和2，4D等人工合成的生长素。这是人类首先认识到的一类生长调节物质。随后发展了多种植物激素。植物激素用于植物组织培养，大大推动了研究的进展，取得许多令人振奋的结果。1937后Write首先建立了人工合成的综合培养基，证明了B族维生素对离体根生长的重要性。同年法国的Cautheret、Nobecourt培养块根和树木形成层使其生长。Write 、Cautheret和Nobecourt确立的植物组织培养的基本方法，成为以后各种植物组织培养的技术基础。1941年，Overbeek等在基本培养基上附加椰乳（CM），使曼陀罗的心开期的胚，离体培养成熟。1943年，Write提出了植物细胞“全能性”学说并出版了“植物组织培养”手册，使植物组织培养开始成为一门新兴学科。1948年，Skoog和我国学者崔澄在烟草茎切段和髓培养以及器官形成研究中发现嘌呤或腺苷可以解除IAA对芽形成的抑制，并诱导成芽，从而确定嘌呤/IAA的比例是控制根和芽形成的控制条件。1955年，Miller等发现了激动素比嘌呤活力高3万倍，细胞分裂素/生长素的比值，成为控制器官发育的模式，促进了植物组织培养的发展。即细胞分裂素与生长素的比例高时产生芽，低时产生根，比值适中时可能维持原组织生长而不分化。通过先加入生长素诱导产生愈伤组织，使原组织脱分化，随后减少或取消生长素而加入细胞分裂素，即在愈伤组织上形成大量的不定芽，切割不定芽，使在含适量生长素的培养基上，不久即可生根，这是植物再生的第一种方式。1952年法国的G.Morel等将感染病毒的大丽花茎切离培养，获得去病毒(virusfree)植株。1953年W.H.Muir发明了用摇床振荡的液体培养，使烟草愈伤组织分散为单细胞或小的细胞聚集体，即细胞悬浮培养技术（suspension culture）。以后发展成用于植物次生代谢产物大规模发酵生产的方法，如芗（人参皂甙、薯蓣皂甙、毛地黄等）、香料（茉莉香精等）、天然色素（甜菜甙色素、紫草素等）、饮料（甜菊甙等）以及调味品等等。同年，Muir还设计出看护培养技术（nurse culture），利用愈伤组织块隔着滤纸或玻璃红诱导单细胞生长、分裂，使培养获得成功。1958年J.Reinert和F.C.Steward分别发表了由胡萝卜直根髓的愈伤组织制备的单细胞，经悬浮培养产生了大量的胚状体（embryoid）和幼植株。这是植株再生的第二种方式。同年，M.Wichson和K.V.Thimann发现采用外源的细胞分裂素，可促使休眠的侧芽启动生长，形成一微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构，将嫩梢切割，可在短期内重复这一过程，嫩梢也可转到生根培养基上生根，这样可不断复制出大量的小植株。这成为植株再生的第三种方式。以上各种成就实现了Haberlandt在1902年得出的设想，植物细胞的全能性已获得大量实验证据，为各国学者所公认。在50年代所做出的成果的鼓舞下和技术基础的支持下，60年代以后，植物组织培养进入了一个新时期。三.蓬勃发展时期进入60年代后，植物组织培养技术得到了迅猛的发展，并且与常规育种、良种繁育和遗传工程技术相结合，开始走向大规模的应用阶段，同时研究工作也更加深入和扎实。1960年，Morel采用兰属(Cymbidin)的茎尖培养，经过茎尖原球茎小植株的方式，使植株获得再生。这种繁殖系数极高的方法成为植株再生的第四种方式。按Morel的方法，1年内可从1个兰花茎尖繁殖出400万株具相同遗传性的健康植株。其后这一技术导致欧洲、美洲和东南亚许多国家兰花工业 (orchid industry)的兴起，获取了巨大的经济效益。与此同时，植物组织培养的研究工作也日渐深入。1960年，E.C.Cookiing采用真菌纤维素酶、果胶酶等酶制剂分离番茄的根，获得大量健康的原生质体。1971年I.Takebe等首次报道由烟草原生质体通过细胞壁再生、细胞分裂等过程再生出完整的植株，确证了植株除体细胞和生殖细胞融合，实现了体细胞杂交，获取了第一个体细胞杂种。1962年Murashige和Skoog 发现了促进烟草组织快速生长的培养基成分，从而使MS培养基成为各个科属植物所广泛适用的培养基。1964年印度的S.Guha和S.C.Maheshwari培养南洋金花未成熟花药获得了单倍体植株。这一获得单倍体植株的技术由于加快了常规杂交育种工作的速度而备受人们的关注。70年代开始，我国掀起了用花药培养单倍体植物的高潮，获得了至少24种以上的花粉植株。计划学时：2学时 属累计学时：3-4学时教学目的：让学生了解组织培养的优点和在农业生产上的应用教学重点：组织培养在农业生产上的应用教学难点：组织培养在农业生产上的应用教学方法：理论讲解教学过程： A 组织教学 B 讲授新课第三节 植物组培技术的应用及展望一、植物组织培养的优点 1、研究材料来源单一，无性系遗传背景一致 2经济方便效率高。 3条件可控误差小培养基中各种成分，环境条件的温度飞光强光质.光周期)变温处理等，完全可控，试验处理易于安排调配，处理间误差很小。 4、生长快周期短、重复性强:这是因为营养及外在条件优良，所以生长迅速。5、周年试验或生产: 因为条件可控，所以不受季节限制，可全年连续试验或生产。二、植物组织培养的应用我国的植物组织培养的研究是在20世纪70年代以后迅猛发展起来的。目前药用植物组织培养的应用主要在：快速繁殖、无病毒苗生产、选育新品种、种质资源保存、次生代谢物的生产几个领域。1快速繁殖在人工栽培植物中，有不少名贵植物，如：兰花、红豆杉、人参、云南黑节草、高山红景天等，生产周期很长，如果常规方法育种或育苗，则需要花费很长时间；另一些植物则繁殖系数小，耗种量大，严重影响了发展速度并增加了生产成本，如；贝母、番红花等；还有一些植物，如：地黄、太子参等，由于病毒为害而退化，严重影响了产量和品质；一些进口南药因种苗奇缺而影响扩大生产，如：乳香等。而药用植物生产需求大量规格统一、性状优良的苗木，这一目标可以通过组织培养手段实现。利用组织培养法每年可繁殖出几万至数百万倍的小幼苗，如：苦丁茶每株试管苗每次继代培养繁殖5倍，按平均每40天切割继代一次计算，每年可继代9次，每株苗理论上可繁殖出将近200万株苗。因此，组织培养对于因病毒病害严重影响产量和质量的药用植物、靠有性繁殖提供种子而种子发育不完善或种子成本高的药用植物、靠无性繁殖提供“种子”而无性繁殖系数低且种子需求量大的药用植物、濒危或濒危药用植物的引种驯化以保护植物资源等具有重要的科研和生产意义。2无病毒苗的生产1952年，Morel和Martin首次证实，通过茎尖分生组织的离体培养，可以获得无病毒的大丽菊植株，证实了组织培养技术对于植物脱病毒的优异作用。采用茎尖培养脱毒的原理是：在感染病毒植物体内，病毒分布并不均等。在生长点病毒含量最低，侵染的病毒使寄主代谢异常，因此造成植物生长的抑制，或形成畸变，产生皱缩、花叶、杂斑等到许多症状，导致产量大幅度下降，以及花变小，色泽暗淡，产量少等品种退化的现象。如：唐菖蒲、百合、地黄、太子参等都存在这样的问题。采用茎尖培养支病毒后，植株生长势强，抗逆能力提高，品质和产量均明显增强。例如：唐菖蒲侵染了黄瓜花叶病毒（CMV）后，植物叶面形成斑纹，而黄色花叶病毒（BYMV）则使侵染后的植物花带斑点，并扭曲畸变。王慧芳（1991）报道将带有CMV和BYMV病毒的唐菖蒲球茎切取茎尖0.5mm,经愈伤组织的培养，脱分化，分化出根、芽后，获得完整植株，经鉴定，成株不带CMV和BYMV病毒。据研究资料表明，去病毒苗的比例高低取决于病毒种类，植物种类及操作技术。例如：百合经处理后，去病毒的百合比例为16%25%，唐菖蒲花瓣组织培养去烟草花叶病毒的比例为30%50%。3、新品种的培育及新物种的创造植物组织培养技术已成为培育新种质的新手段之一。在药用植物上研究和应用的方向主要有三个方面：3.1 单倍体和多倍体培养单倍体经染色体加倍后成为纯系，使突变性状易于表现出来。而且基因重新组合对于的药用植物而言，可以通过酶的作用影响到一系列蛋白质合成及其各种性状，通常具有较高含量的药用成分，同时增强了植株的生态适应性及对逆境的抗耐性。因此单倍体和多倍体培养技术，对于品种选育，改良及遗传分析有重要意义。攀映汉对宁夏枸杞含单核晚期花粉的花药培养，得到来自花粉的单倍体植株。曹有龙等用枸杞花粉愈伤组织悬浮培养产生胚状体也获得了单倍体植株。而以宁夏枸杞未受粉的子房为材料，可获得四倍体和非整倍体植株，其中诱导出的同源四倍体枸杞表现出花和果实大、种子少的特点，充分显示出其潜在价值。高山林等研究多倍体性状与药材质量，发现不同类型丹参多倍体根中丹参酮的含量不同，丛根类型的丹参多倍体品系不仅产量增加，而且丹参酮含量平均比对照增加79%，这样使多倍体巨大性和药用成分含量两个方面得以较理想的组合和统一。目前利用单倍体和多倍体培养技术培育得到新品种的药用植物有党参、黄芪、丹参、枸杞、薄荷等，其中部分品种已产生了可观的经济效益。3.2 原生质体培养与融合原生质体培养和植株再生技术是药用植物生物工程的基础,通过原生质体培养筛选高产细胞系、细胞杂交、以原生质体作为受体系统的基因转化技术都依赖于植物原生质体的培养、融合和植株再生技术。自从植物原生质体培养技术产生以来，许多经济植物，特别是重要农作物如水稻、小麦、玉米、甘蔗、大豆等的原生质体培养工作已广泛开展并取得了相当大的进展11，但原生质体培养在药用植物上的应用相对滞后。从目前的研究进展来看，枸杞、峨参、决明、防风、人参、龙胆、绞股蓝、川芎、前胡等已实现了以原生质体培养获得愈伤组织或再生植株。刘宝12等用黄花烟草叶片愈伤组织和宁夏枸杞下胚轴愈伤组织培养分离获得原生质体并进行融合，实现了远缘遗传物质交流，获得杂种小苗。这为探索通过原生质体融合技术将枸杞中决定药用成分的基因转移到重要经济作物烟草中奠定了基础。3.3 基因工程中转化体系的建立 基因工程是利用重组DNA技术，在体外通过人工剪切和拼接等方法，对生物基因进行改造和重新组合，导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞中表达，生产所需要的基因产物。植物转基因的方法主要有农杆菌介导转移法、基因枪法、花粉管通道法等,前两种方法需要通过组织培养再生植株,我国学者多采用农杆菌介导基因转移法。据报道，迄今所获得的200种转基因植株中80%以上是利用根癌农杆菌转化系统产生的。在组织培养和转化体系建立的基础上，通过转基因技术，引入控制某种性状的基因，对药用植物进行有效的遗传转化，从而达到提高有效成分含量、增强植株抗性和品质、抗除草剂等目的。邱璐等对灯盏花遗传转化中的组织培养受体系统进行试验研究，发现使用75g/ml的chl(氯霉素)作为土壤农杆菌转化培养的选择压力, 使用50g/ml的Gent(庆大霉素)作为转基因植株的选择压力,使用300g/ml的cef(头孢霉素)作为土壤农杆菌转基因的抑菌抗生素,对灯盏花遗传转化效果最佳。在转化体系建立的基础上，结合土壤农杆菌介导的基因转移法，有望获得转基因灯盏花。王慧中等已成功地将外源卡那霉素抗性基因通过根癌农杆菌介导的基因转移技术导入了宁夏枸杞的幼茎外植体，所获得的再生植株经胭脂碱检测、NPT-II活性测定及Southem分子杂交，证明外源基因NPT-II及胭脂碱合成酶基因，已整合到枸杞细胞的核基因组上，并能在植株水平上表达出相应的性状。目前我国已在甘草、丹参、黄芪、表蒿、红豆杉等多种植物药材中建立了农杆菌介导的遗传转化，一些相关的关键基因已克隆，通过基因工程操作，可使这些基因过度表达，就有望增加有效成分的含量。4 植物的离体种质保存植物种质资源是物种进化，遗传研究及植物育种的物质基础，也是人类生存与持续发展的基本条件。目前，全世界面临着环境污染和热带森林资源的破坏，平均每天有2种植物从地球上消失，这是全人类物种财富的损失17。而在生物科学迅速发展的今天，拥有种质资源的多少以及对其研究的深度和广度，对于未来生物科学的研究和生产起着极其重要的作用。因此，许多国家目前都有专门搜集保存资源的种子库，但保存种质资源占地多，维持费十分高昂。现在可借助试管来保存它们。试管保存就是在人为控制条件下，利用组织培养技术保存种质资源。与传统的保存植物种质资源的方法种子库相比，采用植物细胞、组织或器官，能最大限度地抑制生理代谢强度，降低劣变发生频率，达到长期保存种质的目的。实验证明，植物组织甚至细胞可以在4低温或在液氮的低温中贮存几个月或几年不丧失其活力，这为保持植物资源和对植物材料运输提供了方便，越来越多的种质资源和生物制品可在离体条件下运输，由于没有昆虫，细菌和真菌感染，因而在许多口岸获得免检。史永忠等研究铁皮石斛种质资源的低温保存时，发现其试管苗能在4黑暗条件下连续保存12个月，并能正常生长。陈品良等用杜仲的花粉在液氮（-196）中保存，实现了花粉粒的萌发。李明军等用怀山药的无菌苗进行离体诱导，形成微型块茎，发现微型块茎是怀山药离体繁殖和种质保存的又一途径，这将有助于种质资源的保存和交流。目前，离体种质保存虽已进入了较长时间的研究，但因其本身的局限性或技术上的不成熟而在实际应用中受到极大限制。相对而言，超低温保存却显示了其广阔前景，但长期使用冻存材料可使其再生能力衰退、组织培养后代遗传稳定性等仍未解决的问题还有待于进一步研究。5 植物次生代谢物的生产在植物组织培养研究中，发现培养细胞中含有各种特殊的代谢产物、药用成分和各种香精等。其中有些是微生物；有些是人工所不能合成的物质；有些是整体植物中含量甚微或整株植物十分缺乏，而培养细胞中的含量却很高，如人参皂苷在组织培养中中含量占干重的27%,全株中只有4.5%,紫草素在细胞培养物是占有2%,而全株只有1.5%。因此，以培养细胞生产这些有用成分已受到生物学、医学及商业界人士的极大关注。通过愈伤组织或悬浮细胞的大量培养，从细胞或培养基直接提取药物，或通过生物转化、酶促反应生产药物。据不完全统计，目前通过各种培养物中产生的药用成分已有600多种,其中40多种化合物在数量上超过或等于原植物中的含量。从细胞培养物中分离得到的有用物质有：酶类（淀粉酶、淀粉酶、蛋白水解酶、过氧化氢酶、酸性磷酸化脂、糖苷酶、IAA氧化酶、细胞色素氧化酶等）；甾体（地奥甙元、育努皂甙元等）；萜类（角鲨烯、羊毛甾醇、环阿屯醇、人参三醇、人参二醇、油烷酸、人参甙等）；生物碱（麻黄碱、利血平、吲哚生物碱、麦角碱等）；苷类（人参皂苷、三七皂苷、甘草甜苷、薯蓣皂苷等）、色素（大黄素、紫苏宁、红花素、蒽醌、紫草素等）等。1964年，罗士韦首先成功地进行了人参的组织培养，随后我国和其他国家的一些学者将人参的组织培养过渡到工业化生产。目前我国学者已建立了三七、三分三、人参、西洋参、紫草、长春花、丹参、红豆杉等十几种药用植物的液体培养系统，经过对培养基和培养条件的操作已使有用成分达到或超过原植株。并实现了人参10L体积的大规模培养，对其培养细胞进行化学成分和药理活性比较分析，表明与种植人参无明显差异，并已作为美容保健品投放市场，这是我国药用植物生物技术产品商品化的第一个范例。作业：1、 论述植物组织培养技术在农业生产中应用体现在哪些方面？2、根据外植体研究的不同，植物组织培养可分为几个类型？3、名词解释：植物组织培养、外植体、植物细胞的全能性、 计划学时：2学时 属累计学时：5-6学时教学目的：让学生了解组培实验室的设计，所需设备仪器，掌握常用设备、仪器的使用方法。教学重点：组培实验室的设计，所需设备仪器，常用设备、仪器的使用方法。教学难点：组培实验室的设计，所需设备仪器，常用设备、仪器的使用方法。教学方法：理论讲解教学过程： A 组织教学 B 讲授新课第一章 实验室及基本操作第一节 实验室设计及基本设备 快速繁殖的几道主要工序如下：培养器皿的清洗；培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌；无菌操作材料的表面灭菌和接种；放入培养室培养；试管苗的种植与初期管理。整个组织培养工作的地点，应选在安静、清洁，远离繁忙的交通线，但又交通方便的城市近郊，应在该城市常年主风向的上风方向，避开各种污染源，以确保工作的顺利进行。 一、实验室设计与要求以一个年产4万至20万株苗的小规模实验室来说，要求：有23间实验用房，其总面积不应少于4060m，条件好，宽敞些则更方便。房屋可划分为准备室、培养室，无菌操作室等。 1 准备室 要求20m左右，明亮，通风。准备室的任务很繁重，要完成器皿洗涤、培养基配制、分装、包扎、高压灭菌等环节。同时兼顾试管苗出瓶清洗与整理工作。 本室的主要设备及用具有：电冰箱、高压灭菌锅、电炉、不锈钢锅、洗涤用水槽、大型工作台12张、玻璃橱2个，搁架23个、大桌子12 张、干燥箱、蒸馏水发生器、酸度计、普通托盘天平（或电子天平）、移液管、试剂瓶、容量瓶、量筒、烧杯、塑料果菜篮多个等。 2无菌操作室(接种室)如果说准备室因工作内容多，处理事物的数量大，以致在条件许可时面积宜大不宜小，那么无菌操作室却恰好相反了，即在工作方便的前提下，宜小不宜大，宜精细密闭，忌粗陋放散。 无菌操作室也叫接种室，是进行无菌工作的场所，如材料的消毒接种，无菌材料的继代，如丛生苗的增殖或切割嫩茎插植生根等等。这里是植物组织培养研究或生产工作中的最关键的部分，关系到培养物的污染率飞接种工作效率等重要指标。无菌室外应留有缓冲间，进入无菌室前在此更衣换鞋，洗手及处理外界采回准备消毒培养的材料等。缓冲间最好安一盏紫外线灯，用以灭菌。墙上设衣帽钩，门边摆拖鞋或设一鞋箱(小盒)。无菌室要求地面、天花板及四壁尽可能光洁，不易积染灰尘，易于采取各种清洁和消毒措施。可采用水磨石地面或水磨石砌块地面，白瓷砖墙面或防菌漆墙面，防菌漆天花板板面等结构。 本室的主要设备及用具有：吊装紫外灭菌灯l一2盏，超净台、小搁架、医用小推车、无菌操作用的器具（酒精灯、镊子、刀剪、小白瓷圆碟）、常备的消毒灭菌药剂、无菌水等。 3培养室培养室应尽量安排在楼层较高处，以利采光，减少尘埃和杂菌污染的机会。此外应考虑清洁飞干燥，培养室还要讲究保温隔热。如果改建原有房舍作培养室，则应考虑增加窗户，改为双层窗。培养室的天花板亦应有保温层，地面架设地板，以利保温。 本室的主要设备与用具有：培养架与灯光、配电板、石英电力时控器、空调机、控温仪、温度湿度计等。第二节 基本操作一、洗涤 植物组织培养最重要的，也是最基本的要求，就是各项操作都应从无毒害、无污染的培养环境来考虑。 最常用的洗涤剂就是家庭用的洗衣粉及肥皂两种，备一点去污粉也有些用处。如果冷的洗衣粉水效力欠佳，可以增加浓度或适当加热，这已可以处理许多清洗中的问题。1、洗瓶时先将瓶子在清水中泡一阵。2、在水龙头下涮去瓶内污物，沥干水，泡入浓洗衣粉水中，再用瓶刷沿瓶壁上下刷动和呈圆周旋转两个方向刷洗。瓶外也要刷到，不要留下未刷到之处，即不要有刷痕。3、刷后放到水龙头下用流水冲刷4次，以彻底冲去洗衣粉残留物。洗好的瓶子应透明锃亮，内外壁水膜均一，不挂水珠，即表示无污迹存在。通常无须再用蒸馏水涮一遍，直接放入洁净的大果莱篮中，再置搁架上沥晾水汽。 4、移液管之类的仪器，可用橡皮吸球(洗耳球)和热洗衣粉水吸洗，再放水龙头下流水冲净，垂直放置晾干。带刻度的计量仪器不宜烘烤，以免玻璃变形，影响计量的准确度。如洗后急等使用，只要用要吸量的液体吸、弃数次，或用95酒精吸弃数次后，即可使用。 二、灭菌 有菌的范畴：凡是暴露在(来经处理的)空气中的物体，曾经接触过自然水源的物体的表面，都是有菌。它的内部在未经证实之前，也应以有菌物体看待。 以这样的观点检视，即使是前面所说的无菌室，未经仔细处理的大多数地方，都是有菌的。（1）、超净工作台的表面，也是有菌的。（2）、所有的培养容器无论洗得多么干净，是有菌的。（3）、简单煮沸过的培养基是有菌的。（4）、人体的整个外表面和与外界相连通的内表面，如整个消化道飞呼吸道的内表面等等都是有菌的。（5）、我们使用的刀、镊、剪等工具在未经处理之前，都是有菌的范畴。（6）、我们所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物，这些东西很，肉眼是根本看不见的。在条件适宜时它们大量滋生，这时能看到它们的集合体或形成的菌落，飘散的孢子等等。 菌的特点是无孔不入，无处不有，在自然条件下忍耐力强。生活条件要求简单，繁殖能力极强，不采用适当的方法很难除灭它。用物理或化学的方法杀死所有微生物叫灭菌。消毒是指用物理或化学的方法杀死有害微生物。 无菌的范畴：经过高温灼烧或蒸煮过后的物体，经其它物理的或化学灭菌方法处理过后的物体，是无菌的。 常用的灭菌方法可分为物理方法和化学方法两大类。物理方法包括：（1）、干热(烘烤和灼烧)：适用于器具灭菌，将器具先用纸包裹好放入设定温度150的恒温干燥箱，保温2h，取出冷却即可。（2）、湿热(蒸煮或加压蒸煮)：适用于器具和培养基灭菌，设定温度121，灭菌15-20min。（3）、紫射线处理：（4）、清洗和大量无菌水冲洗等技术措施。（5）、过滤除菌法：如超净工作台、空气过滤器、风铃门等。 化学方法有：主要使用化学灭菌剂（见P29）（1）、升汞（2）、福尔马林、（3）、双氧水、（4）、来苏尔（5）、高锰酸钾、（6）漂白粉（7）、次氯酸钠（8）、抗菌素（9）、酒精等等。 植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，甚至超过微生物的培养要求。这是因为培养基含有丰富的营养，稍不小心即易引起杂菌污染，由于它们繁殖极快，同时还分泌对植物组织有毒的代谢废物，最后便使植物组织死亡或失去使用价值。三、无菌操作（见P21）第三节 培养基的成分及其作用计划学时：2学时 属累计学时：7-8学时教学目的：让学生掌握培养基的成分及其作用。教学重点：各种成分的作用教学难点：各种成分的作用教学方法：理论讲解教学过程： A 组织教学 B 讲授新课培养基主要由水、无机营养成分、有机营养成分、激素、PH、琼脂等成分构成。一、无机营养成分植物必需元素分为：（一）大量元素 每升培养基中含量大于0.5mmol时为大量元素，主要有N、P、K、Ca、Mg、S、H、O等。（二）微量元素 每升培养基中含量小于0.5mmol时为大量元素，主要有B、Mn、Zn、Mo、Cu、Fe、Co、cl等。作用：1、组成各种化合物，参与机体的建成，成为结构物质；2、构成一些生理活性物质，参与活跃的新陈代谢；3、元素之间互相协调，维持离子浓度的平衡、胶体稳定、电化学平衡等作用；4、不同器官的发生需要营养元素的浓度不同，一定的元素影响到形态发生和组织器官的建成。二、有机营养成分（一）碳源：通常用蔗糖（1%5%），主要为细胞提供合成新化合物的碳骨架，为细胞呼吸代谢提供底物与能源,并维持一定的渗透压(1.54.1MPa).(二)维生素:参与酶的形成及蛋白质、脂肪的代谢等活动，对生长和和分化有促进作用。用量0.11mg/l,主要有B6、B1、B3、B5、B12、BC、H、C等。（三）氨基酸：是蛋白质的组成成分。常用甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、丝氨酸等。（四）肌醉：是细胞壁的构成材料。对培养物快速生长，胚状体和芽的形成有良好的促进作用。用量50100mg/l。（五）其它有机附加物：对愈伤组织的诱导和维持很有益。如；椰子汁（CM）、酵母提取物（YE）、麦芽汁、番茄汁。据研究椰子乳中含有许多促进细胞分裂的因子，如二苯尿、玉米素等，另外还含有大量游离氨基酸，故椰子乳有促进生长与分化的作用。常以10%的体积比的量加入到培养基中。 由以上两大成分，即无机营养成分和有机营养成分构成的培养基，称为基本培养基或生化培养基。在植物组织培养中常用的基本培养基是M S培养基，它具有无机盐和离子浓度较高的特点，是较稳定的离子平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足大多数植物细胞营养和生理需要，效果良好。MS培养基的主要成分见课本24页所示。随无机营养成分和有机营养成分构成的不同，组培中使用的培养基还有硝酸盐含量较高的培养基如：B5培养基、N6养基、SH培养基；中等无机盐含量的培养基如：H培养基、Nitsch培养基、Miller培养基；低无机盐含量的培养基如：WH培养基、WS培养基、HB培养基等。三、激素（一）生长素类常用的有：吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、2，4-D，ABT生根粉系列等。作用：诱导愈伤组织的形成，促进细胞脱分化；促进细胞伸长生长和细胞分裂，诱导受伤的组织表面形成愈伤，促进生根。诱导效果：2，4-D NAA IBA IAA2,4-D诱导细胞分裂较好,但有抑制植物形态发生的作用,高浓度时容易导致变异发生。一般多用NAA 、IBA 或IAA。一定量的生长素与细胞分裂素配合使用效果更好。（二）细胞分裂素常用：激动素（KT），6-苄基腺嘌呤（6-BA），玉米素（ZT）、2-异戊烯腺嘌呤（2-ip）、吡效隆（4PU，CPPU）和噻重氮苯基脲（TDZ）。作用：促进细胞的分裂和器官分化；延缓组织的衰老；增强蛋白质的合成；抑制顶端优势，促进侧芽的生长及显著改变其他的激素作用。效果：TDZ，4PU ZT 2-ip 6-BA KT通常使用价格适中、性能稳定、人工合成的KT和BA。（三）其他1、赤霉素：具有促进细胞伸长、诱导开花、打破休眠等功能。由于其容易高温分解降低效果，只能采用过滤灭菌的方法。通常用来浸泡种子，打破种子休眠。2、天然激素代用品：如受精1个月的苹果切碎取汁；成熟番茄果汁；蚕豆刚萌发0.5cm幼根的根尖,加水磨汁。一般对组织增殖有作用，对器官分化作用不明显。（四）细胞分裂素/生长素的比例其比例决定了形态发生方向：1、 比例高，细胞分裂素起主要作用，诱导芽的发生；2、 比例低，生长素起作用，诱导根的发生；3、 比例适中，则没有器官分化，只形成愈伤组织。在选择培养基时，要根据诱导目的不同，加入适量的细胞分裂素和生长素，就可有效地控制芽、根的分化。四、琼脂培养基分固体、液体两种。区别在于加入琼脂与否。作用：使培养物得到支持和固定，操作方便，通气良好。一般用量5-12g/L。五、活性炭作用：具有吸附能力，能吸附培养物释放到培养基中的有毒物质，减轻有毒物质对培养物的影响；有利于植物生根。常用0.1-0.5%.但要注意其吸附能力是无选择性的，在吸附有毒物质的同时，也吸附了培养基中的营养物质，降低了激素的作用，故培养基中若添加活性炭，应适当加大激素的用量。D小结：培养基的组成及其作用实验实习一:培养基的配制及消毒计划学时：6学时 属累计学时：9-10学时实验目的：让学生掌握培养基配制的步骤和方法。实验用品：高压灭菌锅、培养瓶、各种药品、吸管、PH试纸、天平称等实验步骤：1、母液的配制 2、培养基的配制3、培养基的高压灭菌实验实习二：无菌操作技术计划学时：2学时 属累计学时：11-12学时实验目的：让学生掌握无菌操作技术实验用品：培养基、操作器皿、无菌水、消毒剂等实验步骤：1、外植体的选取、灭菌 2、切割、接种3、培养观察第三章 植物离体快繁计划学时：2学时 属累计学时：13-14学时教学目的：让学生掌握植物组织培养快繁的基本生产环节教学重点：植物组织培养快繁的基本生产环节教学难点：各个环节的注意要点 教学方法：理论讲解教学过程： A 组织教学 B 讲授新课一、快繁程序阶段I无菌培养物的建立1、制备培养基2、采样、整理、清洗、切割3、表面灭菌、刷洗、切割、接种4、放培养室培养，检除污染的外植体，外植体脱分化启动生长，形成愈伤组织或不定芽。一般需要培养4-6周，这个阶段称初代培养。阶段II繁殖体增殖这个阶段外植体有明显形态变化，开始芽生长，不定芽分化，胚状体发生、原球茎形成等中间繁殖体的建立过程。1、制备分化培养基2、切割中间繁殖体继代，不断重复增殖培养，使中间繁殖体迅速增多。一般4-6周内可增殖3-4倍。阶段III生根培养1、制备状苗生根培养基，使中间繁殖体发育成根芽齐全的再生植株。多采用1/2MS或1/4MS培养基，全部去掉或仅用很低的细胞分裂素，加入适量生长素，一般2-4周即可生根。对于容易生根的植物，可采用以下方法完成再生植株：（1） 延长在增殖培养基中的培养时间就能长出根来；（2） 减少细胞分裂素而增加生长素，将增殖与生根并为一步；（3） 切割粗状的嫩枝在适宜的介质中生根。阶段IV移栽再生植株出瓶，洗去粘附的培养基，种植到灭菌的适宜介质中注意：（1）保持小苗的水分供需平衡可采用薄膜覆盖，温室内种植等方法，提高空气湿度（2）选择适当的种植介质常用珍珠岩、炉灰渣、锯木屑、蛭石等，按比例混合应用，这些介质具疏松通气，适宜的保水性。应用前要高压灭菌。（3）防止菌类滋生可用杀菌剂喷淋7-10天/次，水中加0.1%的肥料或者说/2MS大量元素水溶液作追肥。（4） 适宜的光温条件光线过强会使叶绿素受破坏，并刺激蒸腾加强。温度过高使用权水分失衡，菌类滋生，过低生长迟缓。光照在1500-4000LX或达10000LX之间为宜，喜温植物25度左右，喜冷植物18-20度为宜。小苗成活标准是：发出新叶，长出新根。二、植物快速繁殖的器官形成方式1、 短枝发生型 2、 丛生芽发生型3、不定芽发生型4、胚状体发生型5、 原球茎发生型三、常用术语解释1、外植体：由植物上取来用作离体培养的材料。2、初始培养：最初接种在培养基上的外植体的培养。3、继代培养：将获得增殖的培养体（芽、茎段或带愈伤组织的丛芽团块等）移植到新鲜的培养基上再次或反复多次的切割移植培养。4、继代周期：前后二次继代培养的间隔时间。5、增殖系数：后一次培养物的数量比前一次培养基物增加的倍数。如一个芽经过一个月培养后切割分离成才个芽转移到新鲜培养基上进行继代培养，则它的增殖系数为7。继代周期为一个月。6、脱分化：初始培养的外植体形成愈伤组织，再分化为不定芽或无性胚时，这种初始培养被称为脱分化。所用的培养基被称为脱分化培养基。7、分化培养：经过脱分化阶段的外植体（形成愈伤组织，或肉眼看不到愈伤组织），转移到另一培养基上分化出芽（或小球茎、胚状体）时，称为分化培养。所用的培养基称为分化培养基。8、增殖培养：已分化芽、小球茎和无性幼胚再继续进行增殖，即为增殖培养。9、生根培养：诱导生根形成完整植株，就是生根培养，所得完整小植株便称为组培苗。C小结：快繁的基本生产环节第五节 . 影响植物组织培养成功的因素计划学时：2学时 属累计学时：15-16学时教学目的：让学生了解植物内部因素对植物组织培养成功的影响。教学重点：分析各个因素对组织培养的影响教学难点：分析各个因素对组织培养的影响教学方法：理论讲解教学过程： A 组织教学 B 讲授新课一、植物内部因素（一）植物种不同科、属的植物，组培繁殖的难易程度差异较大。大多数植物种脱分化形成愈伤组织较易，而有些植物由脱分化状态，再分化成不定芽很困难，如：茶花、红松、紫杉等。而有的植物虽能形成不定芽或侧芽，但却很难发生不定根，最终难以形成完整植物。同科不同属、甚至属中不同种或品种，其难易程度也不同。如：同是百合科的风信子、麝香兰、虎眼万年表较易再生植株，而郁金香就比较难。月季、唐菖蒲、水仙等品种之间有差异。植物种之间的差异不仅反映在脱分化阶段，成芽生根阶段，甚至还反映在试管苗出瓶种植的成活率等方面。植物种之间即有共同性也有差异性，不能认为分类越远培养基差异越大，有时同一培养基可适用于不同科属的植物。如：MS+BA23mg/l+NAA0.11.0mg/l具有广谱性。植物种之间的差异在脱分化阶段差异，而在生根阶段差异却较小。（二）外植体1、外植体种类不同的器官、组织，其形态发生有很大差异。例如：有人研究了天香百合和药百合各种外植体产生鳞茎的能力，其诱导率为：叶（0）、雄蕊和花药（0）、花瓣（75%）、鳞茎鳞片（95%）、试管中的鳞茎（100%）。试管中的鳞茎产生100%诱导率属于条件化效应。条件化效应指从培养条件下的植物是取得的外植体已具有被促进了的形态发生能力。如：厚叶莲花掌的叶诱导率为0，用花茎切段才能诱导再生植株，再用这种上再生植株的叶切块作为外植体，就约75%的叶块能再生植株。不同的外植体需要不同的营养和不同的植株激素用量如：小红参叶片形成愈伤组织的培养基以MS+BA2.0+NAA2.0最佳,顶芽和侧芽萌发以MS+BA3-5+NAA0.5-2.0为宜。又如：蝴蝶兰的组培，据报道根采用B5+KT10+NAA5，液体培养，原球茎形成率达70%；叶采用MS+KT10+NAA5+100mg/l椰子乳或苹果汁，原球茎形成率达35%。2、母株年龄一般从年龄较小的植株上剪取外植体，其生活力旺盛，细胞分裂速度快，容易分化出不定芽和不定根，形成完整植株。如：木本植物中胚和实生苗组织具有较高的再生能力。取1-2年生紫杉植株的茎段或芽，其生根能力较强，但母株年龄越大，生根率越低。3、取材部位同一植株不同部位所处的生理学发育年龄不同，按植物生理学的基本观点，沿植物体的主轴而论，从基部开始越向上的部位，越接近发育上的成熟，越不易分生分化。一般幼年的组织比老年组织形态发生力更高。如：月季主茎不同位置的侧芽，越接近基部的产生不定芽的数量越多，生根率越高。4、取材时间组织培养技术不受季节的限制，可以周年生产。但在初级培养时，取材时间不同则关系到快速繁殖的成败。通常诱导率为：生长季节停止生长或休眠期。5、外植体大小过大的外植体由于浪费材料和易感染病菌，显然是不宜采纳的。如：秋海棠的叶切块10mm10mm的块不如5mm5mm，前者1块可能污染，但后者切4块后，可能只有一块污染。但外植体过小，其存活率很低。如：香石竹茎尖为0.09mm时已无形态发生能力。除非是用于去除病毒，否则不宜将外植体切得过小。通常情况下，叶片、花瓣等到面积约为5mm5mm，茎段长约0.5cm。二、环境因子（一）基本培养基1、无机营养不同植物要求的养分不同，所以有不同的培养基配方。基本培养基类型有以下几种： MS培养基及类似培养基MS培养基应用最广泛，其无机盐浓度高，有加速愈伤组织生长的作用，能满足植物组织对矿质营养有需求。类似培养基LS培养基、RM培养基、BL培养基、BL培养基、BM培养基等。 硝酸盐含量较高的培养基B5培养基含较高的硝酸盐和盐酸硫胺素，较低的氨态氮N6培养基广泛用于植物的花药培养SH培养基NH4+与PO43-是由NH4 H2PO4提供的。 中等无机盐含量的培养基H培养基无机盐（大量元素）只是MS培养基的1/2，微量元素种类减少而浓度提高，维生素种类也多于MS。另外还有Nitsch、Miller培养基。 低无机盐培养基WH培养基无机盐种类减少，用量约MS培养基的1/3。WS培养基适用于生根。HB培养基去掉了微量元素，Ca2+和NO3-主要由Ca（NO3）2.4H2O提供,有机成分只保留了盐酸硫胺素。不同植物种，甚至同一植物不同器官，或者组培的不同从阶段对无机盐成分的需求不同。如：水稻、小麦等谷类作物的花粉、花药常用N6培养基，兰科植物常用VW、改良Knudson、Wimber等培养基。大多数植物在诱导分化阶段需求高无机盐，而在生根阶段则需求低无机盐，故通常采用1/2MS或者1/4MS培养基。2、有机营养氨基酸虽然绿色植物能自己合成所有的氨基酸，再进一步合成蛋白质，但为了快速生长与分化，常需要添加复杂的有机营养，如：甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等，其用量约为几毫克到几十毫克，它们不仅能提供有机氮素，还提供相应的有机酸。腺嘌呤有许多报告介绍腺嘌呤及硫盐酸具有促进芽分化的良好结果。从生物化学上说，所有的细胞分裂素都含有腺嘌呤。肌醇据研究肌醇是细胞壁的构成材料，参与了碳水化合物、磷酯代谢及离子平衡等生理活动。在椰子乳中发现有肌醇，当将肌醇加入到培养基中，有促进愈伤组织生长、胚状体和芽的形成。肌醇用量为50-100mg/l。糖主要作为碳源，为细胞提供合成新化合物的碳骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，糖还用来维持一定的渗透势。通常使用蔗糖。不同品种的植物要求不同的糖浓度。如：百合茎尖在糖浓度为30g/l时，可100%产生小鳞茎，在9