镧系离子时间分辨荧光检测法在核酸分析技术中的应用.doc

镧系离子时间分辨荧光检测法在核酸分析技术中的应用游冬青 陈 杞第二军医大学，上海， 200433) 摘要 本文综述了镧系离子时间分辨荧光技术在核酸分折领域中的应用概况，介绍了DELFIA系统、FIAgen系统和EALL系统的使用特点，包括时间分辨荧光分析原理、镧系离子标记DNA探针和运用时间分辨荧光技术检测PCR产物的技术和方法 镧系离子时间分辨荧光(TRF)分析技术是一种新颖的非放射性标记技术。该技术在核酸的定量定性分析中已得到广泛的应用。在检测的特异性、灵敏度、测量速度以及标记物的稳定性方面都显示出一定的优越性。目前国内外将时间分辨荧光法应用于核酸分析领域中主要包括两个方面，是应用镧系离子标记的DNA探针技术进行杂交分析，二是将镧系离子标记技术引入PCR中，使PCR产物鉴定简便易行。本文简述该方法的应用及发展前景。 1 时间分辨荧光分析法原理 在时间分辨荧光分析中使用的示踪剂是镧系离子如铕离子(Eu3+)、铽离子(Tb3+)、镝离子(Dy3+)。与传统的荧光标记物相比，镧系离子的标记物具有斯托克斯位移大、荧光寿 命长、发射波长较窄等特点，有利于降低本底和提高分析的灵敏度。 目前应用于时间分辨荧光法的分析技术主要有三种类型(表1)，即 DElFIA系统（WALLAC公司)、 FIAgen系统(Cy-ber Fluor公司)和EALL系统。 DELFIA系统的特点为形成Eu3+ (NTA)3(TOPO)3型的荧光复合物，其中NTA为2萘酰三氟丙酮，TOPO为三辛基氧化磷。Eu3+螯合剂(聚羧酸型)标记的探针与靶DNA杂交后洗涤，低pH条件下,Eu3+可释放出来与增强液中的NTA与TOPO结合形成最终的荧光复合物。在DNA分析中，该系统检测的灵敏度为10-1810-16mol量的DNA探针。FIAgen系统所用的铕离子螯合剂为47二氯磺基苯1，l0邻二氨杂菲2，9二羧酸(BCPDA)做标记物与Eu3+螯合后团相测量，避免了外源性Eu3+的污染。该系统应用在生物素探针与BCPDA标记的链亲和素(SA)结合方面可取得满意的检测结果。常见的标记SA所形成的复合物有三种，一为BCPDA直接标记SA形成复合物SA(BCPDA)，检测灵敏度为10-1010-11molL；二为SA与标记有160个BCPDA的甲状腺球蛋白(TG)相连形成一个大分子的复合物SATG(BCPDA)160检测灵敏度10-1110-12mol/L；三为活化的SATG(ECPDA)160复合物非共价连上两个BCPDATG形成一个大分子复合构(SBMC)，检测灵敏度为10-1210-18mol/L。 EALI系统为酶促放大镧系荧光系统，是以碱性磷酸酶为标记物，底物为5氟水杨酸磷酸酯(5FASP)，底物水解后所生成的5FSA，在高PH条件下可与TbEDTA形成高强度的荧光复合物，即可进行时间分辨荧光测定。 应用时间分辨荧光法进行核酸杂交分析有两种不同的形式，一种为斑点印边杂交或在微孔条中进行杂交分析。样本核酸不必经过电泳，直接点样到滤膜或微孔中进行杂交。常用DEFLIA系统进行检测，引入杂交体系中的Eu3+需释放出来，与加入的增强液形成荧光复合物方可进行检测。另一种类型为Southern印迹杂交与Northern印迹杂交，特异核酸 的分子大小可通过凝胶电泳分开形成不同的DNA或RNA条带，转移固定到尼龙膜或硝酸纤维素膜上与Eu标记的核酸探针进行杂交分析。DELFIA系统由于需加增强液检测，无 法定位电泳条带，不适于进行Northern印迹杂交与Southern印迹杂交分析。在FIAgen系统与EALL系统中，引入到杂交体系的Eu3+螯合物即为荧光复合物，无需加增强液即可用时间分辨荧光扫描仪进行分析。在Southern和Northern印迹杂交技术中能准确定位并检测特异的DNA或RNA电泳条带。 2 镧系离子标记核酸探针检测DNA杂交技术 镧系离子标记核酸探针是八十年代末发展起来的新技术它克服了放射性核素标记的半衰期短、放射性危害等缺点越来越广泛地应用于核酸杂交分析，是迄今最为理想的一种非放射性检测方法。现将几种镧系离子标记DNA探针及检测方法简述如下。 21 免疫化学测定法 Syvanen应用TRF发展了一种斑点杂交(dot blot)技术。该法是用半抗原AAIF(7碘N乙酸基N2乙酸氨茁)或Sulfone(矾)修饰DNA探针，与固定在硝酸纤维素膜上靶DNA杂交，而后用二步免疫法检测，先加入抗半抗原抗体与半抗原结合，再加Eu3+标记的第二 抗体IgGDTPAEu3+进行检测。最小可测值为20pgAd2 DNA，相当于5105个分子。 22 生物素链亲和素BAS法Dehlen 将生物素链亲和素系统引入TRF中，简称BASTRF法。用PBSIA缓冲液将变性的Ad2DNA稀释至适宜浓度，取100ul加至微孔条中室温过夜，洗二次，250uW/cm2、254nm紫外灯下照射5min。预杂文后，每孔加 入100ul（100ngml）通过缺口转移法制得的生物素在Ad2 DNA探针杂交、洗涤，加200ul2ugmlSA异硫氰酸苯基EDTAEu3+，室温培育,1h后洗涤。每孔加入200ul增强溶液进行测量。线性范围为10pg10ng，变异系数在 5以下，分析灵敏度为10pg Ad2 DNA。Dahlen等还发现以夹心杂交反应代替上述直接杂交方法可提高检测灵敏度。他们用Eu3+SA及夹心杂交法检测大肠杆菌DNA灵敏度达1.9pg。夹心杂交法需要两个相邻但不重叠的探针，个是固定吸附探针；另个是生物素标记检测探针。将吸附探针固定在微孔条中，与靶DNA杂交后，再加入生物素化探针进行杂交。这样，经过二个步骤杂交反应形成吸附DHA探针-靶DNA-生物素化DNA探针的夹心结构，再用Eu3+SA检测。该法中，待测样品不必经过严格的纯化处理，检测方法快捷、简便、稳定和灵敏。 2.3 Eu3+ 化学直接标记法 DNA分子中的胞嘧啶碱基在PH6的亚硫酸钠溶液中可与乙二胺发生转氨基反应，使DNA分子掺入一个活化氨基基团可与Eu3+螯合物共价结合形成Eu3+DNA荧光标记物。Eu3+螯合剂为一种异硫氰酸盐的衍生物4-2(4异硫氰酸基)乙基-2，6-双N，N双(羧甲基)氨乙基吡啶。 Eu3+直接标记DNA的比率，与转氨基反应的程度有关。 DNA在45时，转氨基反应2h，Eu3+标记率为5的核苷酸；在98时，转氨基反应7min、Eu3+。标记率可达10%。Eu3+直接标记核酸探针会干扰杂交时的碱基配对，导致杂交效率下降。但通过提高杂交体系中的探针浓度，仍可获得满意效果。此法可应用于夹心杂交分析及斑点杂交分析，可测范围为10100pgDNA。 24 酶放大时间分辩荧光法EALL 将靶DNA固定到微孔条表面，各孔，加100ul(125ng/L)生物素化探针，杂交、洗涤、加入浓度为5gL的脱脂奶粉封闭再加浓度为500ugL碱性磷酸酶(AP)标记的亲和素(AP-avidin)，培育后洗涤去除游离的AP，加入5-氟水杨酸磷酸酶(5-FSAP)底物液，培育2h，即脱去磷酸，生成5-FSA，可与Tb3+-EDTA螯合物形成荧光复合物，即可用时间分辨荧光显相仪系统测量。最小检测值为3pg。此法还可以用尼 龙膜做固相载体进行斑点杂交分析和Southern印迹杂交分析。 2.5 Psoralen介导的铕标记方法Oser等用一种新的方法标记DNA探针，将一个质粒克隆的探针用限制性内切酶消化成部分单链，载体部分保持双链状态。富含疏基基团的补脂骨素衍生物psoralen在紫外灯下可与呈双链的载体DNA共价结合，DTPA通过多聚的L赖氨酸(pLL)与psoralen结合，最后形成复合物Eu3+-DTPA-pLL-psora1en。这种用psora1en介导的Eu 3+标记核酸探针方法，由于探针杂交区域未被修饰，杂交效率较高。杂交区域的DNA序列呈单链状态，无需在杂交前变性处理DNA，还可阻止杂交反应中DNA探针的自身重组而导致的杂交效率下降。3 镧系离子标记的PCR技术近年来，时间分辨荧光分析技术与PCR技术相结合用于检测特异的靶DNA序列，该技术简称为PCRTRF31 嵌套式PCRTRF法 嵌套式(nested) PCRTRF法的原理是在扩增特定的靶DNA序列之前，先设计两对引物，其中一对为普通引物，另一对引物嵌套在两个普通引物之间，分别标记有Eu 3+和生物素。DNA扩增分两步进行，第一步称为PCRI，以普通引物扩增，第二步称为PCRII，以Eu 3+和生物素标记的一对引物对PCRI的产物进行扩增。二步PCR扩增产物收集在包被有SA的微滴板中，进行时间分辨荧光检测。Dahlen等按照比方法对HIVI cos l011DNA进行扩增，PCRI反应为25个循环，PCRII；反应为10个循环，可检测到5个拷贝的靶DNA、线性范围为550个拷贝。 该方法可用来检测某些改变交了限制性内切酶酶切位点的碱基突变。例如，镰形细胞贫血病是由于B-球蛋白基因的第6密码子中的碱基A突变为T而引起的遗传性疾病。这种点突变同时也改变了D6e I酶切位点，使突变的DNA不能被Dde I酶切，而正常人的DNA可按Dde I酶切。这样两步扩增后的PCR产物固定到微板孔中后加入Dde I酶进行酶切反应，洗涤后，TRF检测，正常人仅得背景信号，杂合体的测量值为纯合体的一半。嵌套式PCRTRF法具有特异性强，灵敏度高的特点。这是由于PCRI中非特异扩增的DNA片段在PCRII中不可能得到进一步扩增，并且PCRII中仅扩增10个循环，即使有非特异性扩增，也是极微量的。PCR与TRF两种超微量分析方法相结合，极大地提高了灵敏度。32 双标记PCR法 该法主要用于基因缺失的疾病诊断。由于不同的镧系离子(Eu 3+，Tb 3+，Sm 3+)螯合物的荧光发射蜂的波长不同，可分别利用不同波长测量时间分辨荧光强度。在同一杂交反应中，应用两种不同镧系离子Eu 3+，Sm 3+标记DNA探针。该探针为等位基因特异的探针，可同时检测PCR产物中两个不同的等位基因，称为双标记TRFPCR法，简称DLTRF-PCR(dual-1abel TRF-PCR)。Litio等对囊性纤维病变的突变基因与正常基因进行DLTRFPCR分析。该病在一个138bp长的区域内缺失了AF 508位点。因此，他在缺失区域内设计了一个由sM34标记的等位基因特异探针，并用Eu3f标记正常等位基因特异的探针，在等位基因外设计一个生物素标记的共同探针。实验中首先将靶DNA按标准程序扩增后，再与上述三种探汁同时杂交。所有的PCR产物均可结合上生物素化探针，结合在包被有SA的微孔条中。在正常基因上杂交结合探针为Eu 3+标记的，杂合子的基因上结合的探针为Sm 3+标记、Eu 3+标记两种探针，纯合子的基因上仅结合上Sm 3+标记的探针。分别用Eu 3+、Sm 3+不同的发射光谱测定各自的荧光计数，可筛查出囊性纤维病的杂合子与纯合子。33 TRFSPCR直接定量法Diamandis介绍了一种在凝胶中直接对PCR产物进行定量的方法。该方法是在一个PCR引物的5端标记上BCPDA。 PCR扩增后，凝胶电泳分离PCR产物，然后将胶浸入到一种含有Eu 3+的溶液中，在浸泡过程中Eu 3+可扩散到胶内，与BCPDA结合形成荧光复合物。用一种特别的时间分辨荧光扫描仪进行定量分析。该技术称为时间分辨荧光扫描(TRFS)PCR技术，简称TRFSPCR直接定量法。34 其它的PCRTRF法LiLio(1992)用PCRTRF法检测HTLVI和 HTLYII (human T lymoPhotropic viruresI and II)，他的方法是分别扩增两种病毒的基因组DNA，再与Eu2?标记的寡核苷酸探针杂交，TRF方法检测。Dahlen(1993)用与此类似的方法检测出。-抗胰蛋白缺乏症的PIZ基因。4 结束话 DNA探针杂交技术与PCR扩增技术对于基础医学研究以及临床各种传染病、遗传病、癌症等疾病诊断均是一项强有力的手段。用时间分辨荧光法检测镧系离子标记的核酸探针和PCR产物，集快速、简便、高灵敏度、安全为一体，并可进行自动化分析，是目前最理想的一种非同位素标记测定方法。 这项新技术已引起生物工作者的广泛重视。我国虽然起步较晚，但