实验一 无菌技术及培养基的配制.doc

实验1 培养基的制备、消毒灭菌倒平板（共6课时）一、实验目的1.了解配制培养基的原理，并掌握配制培养基的一般方法和步骤。2.学习几种常用培养基的配制、分装和灭菌的操作方法.二、实验器材1.药品及试剂：可溶性淀粉，KNO3，K2HPO43H2O，MgSO47H2O，FeSO47H2O，1mol/L NaOH，琼脂，牛肉膏，蛋白胨，NaCl，马铃薯2.仪器及其它试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、药匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸(5.5-9.0) 、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠、PH试纸三、实验内容1.分组配制高氏一号培养基300ml。配方：可溶性淀粉20g NaCl 0.5g、 KNO3 1g 、K2HPO43H2O 0.5g MgSO47H2O 0.5g FeSO47H2O 0.01g 琼脂 15-25g 水 1000ml pH 7.4-7.62.配制牛肉膏蛋白胨培养基100ml配方：牛肉膏3g 蛋白胨10g NaCl 5g 琼脂20g 水1000ml PH 7.4-7.63.配制马铃薯培养基100ml配方：马铃薯200g 蔗糖20g 琼脂20g 水1000ml pH自然4.包扎材料：试管，培养皿，涂布棒，吸管，枪头盒等。5.灭菌。6.摆斜面，倒平板，放冰箱。四、方法步骤（一）培养基的制备与分装1.称量 按培养基配方比例依次准确地称取药品。可溶性淀粉先用少量热水溶化后再加入其他成份，补足所需水分，混匀后加入琼脂。2.熔化 在沸水浴锅中加热熔化。3.调pH 用1mol/L NaOH调pH至7.4-7.6。4.过滤 趁热用多层纱布过滤5.分装 将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装试管时，注意管口不要沾上培养基。液体分装装量不超过试管的1/4，固体分装装量不超过试管的1/5，分装三角瓶的量不超过三角瓶容积的一半，半固体分装装量为试管的1/3，灭菌后垂直待凝。6.加棉塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包扎一层牛皮纸。试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。7. 为了保证实验顺利进行，要求把实验用器皿清洗干净。保持灭菌后无菌状态，需要对培养皿、吸管等进行妥善包扎。试管和三角瓶要做棉塞。这些工作看来很普通，如操作不当或不按规定要求去做，会导致实验的失败。因此应看作是微生物实验的基本操作。（二）器皿包扎为了灭菌后仍保持无菌状态，各种玻璃器皿均需洗净后包扎。1、培养皿 洗净烘干后每10套迭在一起，用牢固的纸卷成一筒，外面用绳子捆扎，以免散开，然后进行灭菌。到使用时在无菌室中才打开取出培养皿。2、吸管 洗净烘干后的吸管，在口吸的一端用尖头摄子或针塞入少许脱脂棉花，以防止菌体误吸口中，及口中的微生物吸入管而进入培养物中造成污染。塞入棉花的量要适宜，棉花不宜露在吸管口的外面，多余的棉花可用酒精灯的火焰把它烧掉。每支吸管用一条宽约45厘米，以45左右的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，吸管的另一端用剩余纸条迭打结，不使散开，标上容量。若干支吸管扎成一束，灭菌后，同样要在使用时才从吸管中间拧断纸条抽去吸管。（演示）3、试管和三角瓶 试管和三角瓶都要作合适的棉花塞。棉花塞的作用是起过滤作用，避免空气中的微生物进入试管或三角瓶。棉花塞的制作要求使棉花塞紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，不能过松，过紧易挤破管口和不易塞入，过松易掉落和污染。棉花塞的长度不少于管口直径的二倍，约2/3塞进管口。若干支管用绳子扎在一起，在棉花塞部分外包，油纸或牛皮纸再在纸外用绳扎紧。三角瓶每个单独用油纸包扎棉花塞。（演示）。（三）、高压蒸汽灭菌锅湿热灭菌。高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌器装置严密，输入蒸汽不外逸，温度随蒸汽压力增高而升高，当压力增至103206kPa时，湿度可达121.3-132。高压蒸汽灭菌法就是利用高压和高热释放的潜热进行灭菌，为目前可靠而有效的灭菌方法。适用于耐高温、高压，不怕潮湿的物品，如敷料、手术器械、药品、细菌培养基等。压蒸汽灭菌的关键问题是为热的传导提供良好条件，而其中最重要的是使冷空气从灭菌器中顺利排出。因为冷空气导热性差，阻碍蒸汽接触欲灭菌物品，并且还可减低蒸汽分压使之不能达到应有的温度。操作方法：1、在灭菌锅中盛蒸馏水直至高水位灯亮；将用试管分装好的培养基、包装好的培养皿等玻璃器械放入灭菌器内；2、旋紧上盖，设定灭菌条件：103kPa，121.3，开始灭菌；3、加热，打开排气活门，放出冷空气（一般在水沸后排气5分钟左右），关闭放气活门，使压力逐渐上升至103kPa，温度达121.3，维持20分钟后，排气至压力显示“0”时，慢慢打开盖子。如果突然开盖，冷空气大量进入，蒸汽凝成水滴，使物品潮湿，且玻璃类易发生爆裂。（四）、倒平板、摆斜面1.灭菌完毕，将试管培养基冷至50左右，将试管棉塞搁在玻棒（或木棍）上，搁成斜面，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。2.在超净工作台上将三角瓶中无菌培养基倒入无菌培养皿中（演示）3.将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448h，以检查灭菌是否彻底。4.将培养基放入4冰箱待用。五、注意事项：高压蒸汽灭菌法：第一，无菌包不宜过大（小于50cm30cm30cm），不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流易渗透到包裹中央。消毒前，打开贮槽或盒的通气孔，有利于蒸汽流通。而且排气时使蒸汽能迅速排出，以保持物品干燥。消毒灭菌完毕，关闭贮槽或盒的通气孔，以保持物品的无菌状态。第二，布类物品应放在金属类物品上，否则蒸汽遇冷凝聚成水珠，使包布受潮。阻碍蒸汽进入包裹中央，严重影响灭菌效