机能实验设计.doc

机能学实验设计大纲实验名称： 探讨乌司他丁(UTI)在不同时间点治疗脓毒血症的各重要脏器的疗效课题来源：自选设计班级：2007级临床医学本科2班设计人员：张芳设计日期：2010年3月25日指导老师：何彦芳成都医学院实验技术教研室2010年制一、实验设计的目的意义：实验设计的目的意义，国内外研究现状，存在的问题，解决问题的思路。目的与意义: 脓毒血症是机体免疫系统受到强烈刺激，进而引起多种生物级联反应所致，包括炎症反应过程、凝集纤溶系统改变等。在炎性疾病状态下内源性的乌司他丁(UTI)被严重消耗，使其不足以抵抗剧烈炎症的损害，此时提供外源性的UTI，对于保护机体免遭炎性介质的损害十分有必要。复制脓毒血症模型，直接使用外源性的乌司他丁(UTI)药物尾静脉注射治疗脓毒血症。本实验的目的即在于对探讨UTI在脓毒血症组的防治中其重要器官（如心、肝、肺、肾）在不同治疗时间内的功能变化，具有十分重要的意义。国内外研究现状：脓毒症( sepsis) 是严重创伤、烧伤及大手术后常见的并发症。目前对脓毒症的研究虽已进入到细胞、分子和基因的水平, 然而,国内外流行病学调查显示患病率呈逐年上升的趋势1-2。有国内文献3 报道, 我国严重脓毒症和多器官功能障碍综合征(MODS) 的死亡人数高达每年100 万人以上。脓毒症发病机制非常复杂, 临床救治十分困难, 涉及感染、炎症、免疫、凝血及组织损害等一系列基本问题, 并与机体多系统、多器官病理生理改变密切相关4-5。脓毒症是危重症医学研究的热点与难点，具有发病率高、病死率高、住院费用高等“三高现象”。美国每年有近75万脓毒症患者，每日有近500例患者死于重症脓毒症，病死率约为30，在欧洲每年估计有15万人死于脓毒症6-7。应对脓毒症的巨大挑战已成为国内外医学研究的重大课题。凡脓毒血症者至少伴有1个以上器官功能不全或衰竭,出现低血流灌注或低血压。发病率以老年(年龄 65 岁) 、原有慢性消耗性疾病及免疫功能低下者较高,尤在重症监护房中多见。病情严重程度通常可采用改良的APACHE(急性生理学与慢性健康情况评估) 积分进行预测。严重脓毒血症的病死率仍高达35%45%8。乌司他丁（UTI）是从尿中分离纯化出来的一种糖蛋白,具有稳定细胞膜及细胞亚膜、稳定溶酶体膜抑制溶酶体释放、清除自由基、抑制炎症介质释放、改善微循环衰竭状态,抑制蛋白质分解代谢亢进,以及多种蛋白酶活性等药理作用,能够抑制胰蛋白酶、2糜蛋白酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、磷脂酶A2 和纤溶酶等多种酶活性,并对缺血再灌注损伤有保护作用9-10. UTI来源于人体，无免疫原性，安全性高。健康男性30万u/10ml静注后在肾、肝迅速积累,5 min达到峰值，以后迅速下降；消化器官(胃、小肠、结肠、胰、胆囊)给药15-60 min达到峰值，消除半衰期约为40 min，其生物利用度为100。UTL主要通过肾脏代谢，给药12 h后，绝大部分都通过尿和粪便排出体外11-12。乌司他丁不仅对炎症反应过程中造成组织、细胞损伤的毒性介质有拮抗作用，同时还可促进特异性免疫功能恢复，从而对机体器官起到保护作用13-14。国内外已证实乌司他丁对脓毒血症组心、肺、肝、肾功能确有明显保护作用，能降低治疗组多器官功能障碍综合征(M0DS)的发生率及病死率。但是目前还没有文献研究乌司他丁在不同时间点治疗脓毒血症各病变脏器的疗效，即脓毒血症发生后各脏器病变的最坏时间及经乌司他丁治疗后各脏器改善的最佳时期，为临床用药提供依据。存在的问题：SD大鼠行盲肠结扎穿孔术后，由于组织坏死，肠道组织通透性增加，细菌移位，形成脓毒血症，严重者导致多脏器功能失常综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)发生。这是ICU 患者中最常见的死亡原因之一。而UTI能够阻断全身炎性反应综合征(SIRS)多脏器功能障碍综合征(MODS)的进程，显示出较强的脏器功能保护作用。但针对脓毒症、MODS时微循环障碍导致脏器灌流不足而选择经静脉灌注给药时，有望进一步提高UTI对心、肺、肝、肾功能衰竭的早期诊断提供预警、判断预后提供依据和指标。解决问题的思路：本研究以盲肠结扎穿刺法( cecal ligationand puncture, CLP) 复制脓毒血症并作实验对照组和假手术组对照,分别观察记录对脓毒血症动物行使乌司他丁(UTI)静脉注射4h、8h、12h治疗，SD大鼠存活率及相关指标变化的数据分析。参考文献：1姚咏明,盛志勇,林洪远,等.脓毒症意义及诊断新认识J.中国危重病急救医学,2004,16(6):321-324.2Snowden C,Kirkman E.The pathophysiology of sepsis.CEACCP,2002,2:11-14.3李志军.菌毒炎并治与多器官功能障碍综合征J.中国中西医结合急救杂志,2004,11(6):435-438.4李文娟,颜亮,李经华等.脓毒症大鼠生命体征变化的低应激连续观察J.实用医学杂志,2008,24(4):531-533.5Gerlach H, Toussaint S. Organ failure in sepsis J . Curr Infect Dis Rep, 2007, 9( 5) : 374- 3816杨振林,郑树森,朱峰,等.两种不同途径应用乌司他丁治疗重症急性胰腺炎的疗效观察J.中华肝胆外科杂志,2OO5,11(2):101-103.7梁小仲,姚华国,张媛莉.乌司他丁在脓毒症时脏器保护作用的研究进展J.医学综述,2OO6(8),l2(l6):1008-1010.8侯世荣.脓毒血症的研究进展J.江苏医药杂志.2001 (6) ,27 (6):444-445.9Okuhama Y,Shiraishi M,Higa T.Protective effects of ulinastatin against ischemia reperfusion injury.J Surg Res,1999,82(1):3442.10应斌宇,孙来芳,程碧环等.乌司他丁对创伤弧菌脓毒血症实验大鼠细胞因子的影响和意义J. 实用医学杂志,2004,20(4):362-364.11龙威.乌司他丁研究进展J,中国医师进修杂志.2006（8）,29（8）:66-68.12何俊峰,山峰.乌司他丁的临床应用进展J.山东医药,2007,47（28）:118-119.13林洪远,盛志勇.脓毒症免疫调理治疗的新思路J.中国危重病急救医学,2004,16(2):67-69.14吴騑,余小云,雷涌等.乌司他丁对危重患者器官功能保护作用的研究J.中国中西医结合急救杂志,2008,15(5):269-271.二、实验设计方案（实验设计目标,拟解决的主要问题, 实验动物设计,实验专业设计，实验统计设计,实验方法设计，可行性分析,预期结果，实验设计工作时间安排）。（一）实验设计目标，拟解决的关键问题设计目标：对复制SD大鼠脓毒血症模型后使用乌司他丁可以缓解脓毒血症组的心、肺、肝、肾功能症状。拟解决的关键问题：实验模型的制备。对试验性脓毒血症的模型进行分组与实验结果分析。（二）实验设计1、实验动物设计（1）实验动物的选择取SD大鼠48只，体重180220g，雌雄各半。（2）遗传背景 SD大鼠遗传背景：封闭群远交种大鼠。（3）微生物学质量控制SD大鼠微生物质量要求：普通级动物要求。（4）SD大鼠育种繁殖繁殖方法：近交繁殖初始动物的选择：挑选一对或几对具有育种目标要求的性状的全同胞兄妹。性别鉴定：1、雄鼠的生殖器距肛门较远2、雄鼠生殖器与肛门之间长毛3、雄鼠的生殖器较雌鼠大 4、雌鼠乳头较雄鼠明显性成熟期：2-3月龄；实配年龄：3.5月龄左右；成熟时体重：雄250g以上，雌150g以上。发情鉴定：动情期大鼠外阴部肿胀红润，抚摸其身体出现脊柱前凹、抬臀等行为现象。配种：动情前期交配 交配形式：采用全同胞兄妹交配形式妊娠诊断：摸胎法、阴道涂片法、外形涂片法、直肠检查法育种代数：作为亲本的全同胞兄妹（初始动物）记为0代，按雌雄1：1进行交配，所生后代记为第1代，从中又选留满意的一对或几对全同胞兄妹作亲本，按雌雄1：1进行交配，以此类推，直到20代以上。个体选择：选择留繁殖力强，生活力强，特别是目标性状和基因。保种方法：平行线系统扩大繁殖生产方法：交通信号灯方法(5) 饲养管理SD大鼠环境标准：实验动物饲养室的温度为18-19，相对湿度为40%-70%，每小时换气次数为10-20次，噪声在60分贝以下，每立方米空气中氨浓度在14mg以下，工作照度为150-300lxSD大鼠设施：开放系统SD大鼠笼具及垫料：采用无毒塑料笼具，垫料选用具良好吸湿性、无毒性、无异味、尘埃少的材料如电刨花，垫料须经高压蒸汽灭菌SD大鼠饲喂：饲喂小鼠全价营养颗粒饲料，饲料的消毒灭菌应达到相应等级小鼠微生物控制的要求。饲喂采取“少量勤添”的原则，每周加料2-3次，饮水应保证连续不断，每周换水2-3次，垫料每周更换1-2次。SD大鼠饲养环境卫生消毒：饲养室的消毒隔离工作是管理中重要的一环，必须引起高度重视， 它是保持大鼠等级的关键。饲养员进入饲养室前必须更衣，肥皂水洗手并用清水冲洗干净，戴上消毒过的口罩、帽子、手套后方可进入；饲养室内保持整洁，门窗、墙壁、地面、鼠盒、架子每天擦洗;每天用0.1新洁尔灭或其它消毒剂消毒,隔周更换消毒剂品种，每月进行一次大消毒，用0.1过氧乙酸喷雾消毒效果较好。垫料、饲料经高压消毒后放到清洁准备间储存，但储存时间不超过15天。 鼠盒、饮水瓶每月用0.2过氧乙酸浸泡3分钟或高压灭菌。 我们选用SD大鼠作为实验动物，有以下几点理由：1）、SD大鼠易得到，容易饲养，在科研工作中被广泛利用。2）、SD大鼠与人的某年龄时期是对应的（SD鼠24月龄相当于人的衰老早期，而且24月龄以上的SD鼠是研究老年病学的首选动物）。3）、SD大鼠具有繁殖周期短、产仔多、生长快、饲养方便，性成熟早、性周期短、繁殖力强的特点，常用于心血管实验的研究。4）、考虑到遗传学的因素， SD大鼠都采用20代以上全同胞兄弟姐妹或亲子交配的近交系动物，这样可以减少品系内的个体差异，可使其近交系数达到F=98.6%。5）、对疾病的抵抗力较强，尤其对呼吸道疾病的抵抗力很强，广泛用于药理、毒理、药效及GLP实验。及GLP实验。2、实验专业设计选用SD大鼠作为实验动物，给予乌司他丁静脉注射，观察对实验性脓毒血症组的治疗作用，对心脏测心脏GqP11 含量；对肺观察促炎细胞因子，肺表面活性物质等；对肝测血红素加氧酶(Heme Oxygenase, HO )，丙二醛(MDA) 含量；对肾测血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)指标。3、实验统计设计实验统计设计中应始终贯彻随机、对照、重复三大原则。（1）随机：选正常20代以上近交系健康体重相近SD大鼠70只，将70只SD大鼠按体重由小变大编号后，得结果如下：动物编号：1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20.70从随机数列表抽取n=70的随机数字，将其安排到动物编号下。以动物编号下的随机数字除以7，余数为0的为假手术A组，余数为1的为实验模型B1组，余数为2的为实验模型B2组，余数为3的为实验模型B3组，余数为4的为实验模型C1组，余数为5的为实验模型C2组 ，余数为6的为实验模型C3组。（2）对照：本课题的研究我们采取了真性手术与假性手术之间的对照。（3）重复：本实验采用的是每实验小组有10只SD大鼠，具有一定的重复性。（4）统计数据收集：本实验搜集计量资料,实验过程中因麻醉意外，手术失败造模不成功以及未到4h、8h、12h小时内死亡的均弃去不用。实验动物是随机抽取的，重复大量实验也符合统计学的基本原则。 附表：实验结果相关指标的记录指标组别心脏GqP11 含量 肺 肝 肾死亡率促炎细胞因子肺表面活性物质丙二醛（MDA）胆红素的nmol数血清尿素氮（BUN）血肌酐（SCr）A组B组B1组B2组B3组C组C1组C2组C3组（5）统计数据分析本实验采用计量资料来测定各种指标的数值，所有数据均采用平均数标准差（s）表示，三组间实验数据比较行完全随机单因素方差分析，组间两两比较行q检验，B1、B2、B3组模型行t检验，均以0.05作为显著性检验水准。以心脏GqP11 含量实验数据为例，如下：（1）建立检验假设H0：=（各组心脏GqP11 含量总体均值相等）。H1：、不等或不全相等，0.05。（2）计算统计量 利用统计学专业软件SPSS做One-way ANOVA 。( 3 ) 查F值表，确定P值，得出结论。 B1、B2、B3组模型比较行t检验，以B1与B2模型组之间的比较为例，其方法如下：（1）建立检验假设H0：=（两组心脏GqP11 含量总体均值相等）。H1：、不等或不全相等，0.05。（2）计算统计量 X=(X1+X2+X3+Xn)/n=(Xi-X)2/(n-1) t=（x-u）/Sx( 3 ) 查t值表，确定P值，得出结论。4、实验方法设计实验技术路线SD大鼠 C组脓毒血症组B组脓毒血症组A组假手术组C1、C2、C3静脉注射以1.2万单位kg生理盐水B1、B2 、B3: 静脉注射以1.2万单位kg乌司他丁8h腹腔注入等量生理盐水分析比较心脏GqP11 含量、肺（促炎细胞因子、肺表面活性物质）、肝（丙二醛（MDA）、胆红素的nmol数）、肾（血清尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）分析比较心脏GqP11 含量、肺（促炎细胞因子、肺表面活性物质）、肝（丙二醛（MDA）、胆红素的nmol数）、肾（血清尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）分析比较心脏GqP11 含量、肺（促炎细胞因子、肺表面活性物质）、肝（丙二醛（MDA）、胆红素的nmol数）、肾（血清尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）分析比较心脏GqP11 含量、肺（促炎细胞因子、肺表面活性物质）、肝（丙二醛（MDA）、胆红素的nmol数）、肾（血清尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）分析比较各组心脏GqP11 含量、肺（促炎细胞因子、肺表面活性物质）、肝（丙二醛（MDA）、胆红素的nmol数）、肾（血清尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）实验技术方法（1）随机抽样：随机正常20代以上近交系健康体重相近的SD大鼠50只，并分别编号，再随机分成5组。（2）实验分组：详细见上动物分组。（3）实验手术：ABC组同时取SD大鼠，12 h前禁食、水,5组大鼠均采用1.5%的戊巴比妥钠腹腔麻醉,腹腔局部脱毛。 （4）模型复制：将50只SD大鼠编号，并随机分为5组，麻醉。脓毒血症组：采用腹正中切口,开腹找到盲肠,在距盲端1厘米处结扎,用12号针头贯穿,然后将盲肠移入腹腔,缝合切口,置入笼内自由活动,不限饮食，按12万单位kg静脉给乌司他丁。脓毒血症小鼠造模指标评价：手术组(CL P)小鼠手术后表现体重减轻、全身毛发蓬松, 安静,喜欢独处角落处。术后12 d 内, 多数小鼠可因盲肠末端变黑坏死, 穿孔及发生了弥漫性化脓性腹膜炎而死亡。对照组：同样开腹,但是不结扎、不穿孔，缝合切口,置入笼内自由活动,不限饮食，用相同容量的等渗盐水代替；每隔34 h 观察1 次;再分别于6h、12h、24h小时麻醉后采血并处死再进行相关指标的记录研究。（5）处理措施：1）凋亡细胞的制备：取出心、肺、肝、肾组织分别用PBS 漂洗干净后,浸泡在含PBS 的平皿中,剪碎组织后放入试管中,加入3ml PBS 液,及0.1%的胶原酶,37温箱消化48h ,离心1000r/min ,1015 min ,去上清,PBS液漂洗、离心、去上清并重复23次;计数活细胞及细胞数为1046/ mm3 。使用PI/ AnneximV 双染色法,用流式细胞仪进行测试。2）生化指标测定免疫印迹法测定心脏GqP11 含量:用10%SDS-PAGE分离心肌细胞膜蛋白,25 V ,10 h 将蛋白转移至硝酸纤维素膜,5 %脱脂奶粉PBS 进行非特异性封闭。加入1：125 抗GqP11 抗体4过夜,PBS冲洗后,加入12500辣根过氧化物酶标记的抗,25孵育1h。冲洗后加入化学发光剂进行曝光。应用LEICA Q550IW图像分析系统对所得区带进行扫描。以假手术组动物GqP11 积分光密度为100 % ,与脓毒血症组进行比较。肺促炎细胞因子的检测：用放射免疫分析法测定肿瘤坏死因子-(TNF-)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-8； 肺功能：肺表面活性物质（PS）含磷脂(PL)的组分磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)和蛋白质。这些物质的含量的测定方法：用磷脂酶水解磷脂，然后用氧化酶氧化产物得到H2O2，最后以Trinder反应显色，即H2O2与4-氨基安替比林及酚结合，生成红色醌亚胺后,比色测定含量。用考马斯亮蓝法测定蛋白含量：样品100ul加5ml考马斯亮蓝试剂混合，26min内检测，波长595nm，标准品为牛血清白蛋白。肝丙二醛（MDA）含量测定：Lowry 法测定肝细胞蛋白浓度,硫代巴比妥酸比色法测定MDA 含量。肝HO(微粒体)提取及活性测定:将肝组织剪碎,加3倍体积预冷的含蔗糖的Tris缓冲液,匀浆,13500g、4离心20min ,取上清105000g、4离心1h ,弃上清、沉淀用0.1molL-1的磷酸钾缓冲液(pH 7.4)溶解。利用硫酸铵沉淀、透析法从大鼠肝脏中提取胆绿素还原酶。HO活性测定反应体系中含HO 0.5mg、Hemin20molL-1、胆绿素还原酶4mg、NADP0.8 mmolL-1、G-6-P 4 mmolL-1及G-6-PD 1U。反应体积1ml ,最后避光加Hemin ,于37水浴避光反应20 min 后冰浴终止反应,分光光度法测定D463和D530。胆红素消光系数40nm-1cm-1 ,利用( D463-D530)401/2 1/3 计算1mgHO1h催化血红素降解生成胆红素的nmol数,并以此来表示HO活性。肾功能测定：用全自动生化分析仪测定各时间点的血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，SCr)含量。（三