流式免疫染色.doc

流式免疫染色 （一）免疫荧光染色免疫荧光染色是进行免疫标志分析的关键步骤，主要包括直接和间接免疫荧光染色两种方法。间接免疫荧光染色是采用特异的无荧光标记的一抗与待测标本反应，经溶血、洗涤后，加入标记荧光的一抗抗体，经过孵育、洗涤后上机检测。在应用FCM的 初期，由于标记荧光抗体的单抗较少，多采用间接免疫荧光标记方法。而随着抗体的发展，目前标记荧光的抗体越来越多，因此不必再采用此方法了。而间接标记的 方法难以进行多色的标记，这是该方法的另一个主要缺点。再加上操作复杂、费时、信噪比高，因此目前基本不再应用了。但是，在科研中需要研究一些新的抗原， 而这些抗原可能无直接标记荧光的抗体，此时只能采用此方法。 直接免疫荧光染色是在标记时加入连接着荧光素的特异抗体，该方法具有操作简单、背景荧光低、信噪比低、可同时标记多色抗体等诸多优点，目前广泛应用各实验室。 按照同时加入连接着标记荧光素抗体的数目不同，直接免疫荧光染色法可分为单色和多色免疫荧光染色法。1 单色免疫荧光染色法 在每一管待测的标本中加入一种荧光素标记的单克隆抗体与待测标本反应，经溶血、洗涤、固定后进入流式细胞仪检测，省去了加二抗的步骤。因单色标记法每管只能检测一个抗原，难以在混合的细胞群体中检测特异细胞的抗原表达，往往不能满足目前的临床检测需要，应用较少。2 多色免疫荧光染色法 用2种、3种、4种或者4种以上单克隆抗体分别标记不同荧光素（经不同的荧光检测通道），同时与待测细胞反应，经溶血、洗涤、固定后进行流式细胞仪检测，每管可同时检测多种抗原的表达。目前应用较广的是三色（FITC、PE和Percp）和四色（FITC、PE、Percp和APC）免疫荧光标记法。随着多激光管流式细胞仪的出现、标记单克隆的荧光素种类的增加，4色（6色、9色、17色等）以上免疫荧光标记逐渐应用于科研和临床检测，为精确地界定不同类型的细胞提供了可靠的保障，而且可以同时观察多种抗原间的表达关系，大大减少了重复抗体的使用，有效节约了抗体和标本用量。更重要的是可以提供更多的信息。但4色以上免疫荧光标记对仪器的要求更严格，同时补偿的调节更为复杂，目前应用还未普及。 根据标记抗原部分的不同，可分为细胞表面和细胞内抗原染色，标记的方法有差别，后者需要固定、破膜等步骤，下面以4色免疫荧光标记为例，着重介绍细胞表面抗原和细胞内抗原染色的步骤。（1）细胞表面抗原标记细胞表面分子主要是从细胞内合成后表达在细胞膜表面，各种细胞表面抗原或受体的流式细胞表型在临床中应用最广泛，标记和检测也相对简单。1） 分别加入四种荧光素FITC、PE、PerCP和APC标记的单克隆抗体，不同试剂生产生产的抗体依据说明书和细胞总数来确定抗体用量。以BD公司的抗体为例，以1X10e6细胞，FTIC、PE和PerCP标记的抗体用量一般分别为20ul，APC标记的抗体用量为5ul。2） 标记：按照上述标本准备方法，加入适量50-100ul的抗凝骨髓（或其他类型）标本，充分混匀后室温避光孵育15min。3） 溶血：加入1XFACS溶血素2ml，低速涡流混匀，室温避光静置8-10min；如标本量较大，红细胞较多，需多加入1ml溶血素。溶血后以300g离心5min。4） 洗涤：弃去上清，加入1ml含有0.1%NaN3和1%-2% BSA的PBS洗液，以300g离心洗涤5min。5） 上机检测：弃去上清后加入PBS200-500ul（依细胞浓度而定），上机检测。如不能就是上机检测，则加入同样体积的1%多聚甲醛，混匀后置于4冰箱内保存，一般不超过24h。另外，部分特殊要求的标本需要不同的方法。例如为了避免FC受体的非特异性结合，在标记Kappa和lambda抗体石，要先用无血清PBS洗涤待测标本3次，离心后再标记、溶血、洗涤和上机检测。（2）细胞内或核内抗原标记除 表达在细胞表面的分子外，细胞内还存在大量分子或待分泌的细胞因子等，它们发挥着重要的生理作用。了解细胞内或核内抗原、细胞因子的表达情况，对临床疾病 的诊断、预后判断及发病机制的研究等均有重大意义。但是，与细胞膜表面抗原标记相比，细胞内或核内抗原的标记首先需要透膜处理，而透膜是否合适直接影响胞 内抗原的标记，因此在检测时要特别小心。随着流式分析技术的不断发展，目前细胞内或核内抗原的应用正逐渐增多。下面将简述在血液学主要涉及的三种最常用且 具有代表性的抗原标记方法：细胞内和核内抗原分析、细胞内细胞因子的测定。 在血液系统疾病的诊断中，常需要鉴别诊断细胞的系列特性。而一些系列特异性标志首先出现于细胞内或核内。例如髓系标志物髓过氧化物酶（MPO）、B淋巴细胞抗原标志物、T淋巴细胞抗原标记物、未成熟细胞抗原标志物、B淋巴细胞和浆细胞的抗原标志物等，对于诊断不同类型的白血病和淋巴瘤具有重要的临床价值。 检 测细胞内或核内抗原时通常需要同时标记细胞膜表面抗原，与单纯标记膜表面抗原的主要区别是首先标记膜抗原，然后在标记细胞内或核内抗原前对细胞膜和核膜进 行透膜和固定，即在细胞膜和核膜上打孔，以便让荧光素标记的抗体自有通过细胞膜和核膜，同时又不能破坏细胞的结构，并尽量保持靶抗原的抗原性和细胞的散射 光特点。对胞内抗原的检测，透膜是关键的步骤。如果透膜不完全，可能造成假阴性。而透膜不好，则改变CD45和SSC特性。文献报道某些胞内抗原需要不同的透膜剂。因此在进行胞内抗原的检测前应该进行预实验，以选择合适的透膜剂。另外在观察结果时可以在标本中残留的正常细胞作为内对照。例如检测MPO时，正常粒细胞应该为阳性。检测Ccd3时，正常T细胞应为阳性。而这些正常细胞如果为阴性，说明本次检测检测的结果不可靠。应分析失败的原因是什么，