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阳离子抗菌肽的研究进展 摘要 抗菌肽(antibacterial peptides)广义上是指在多种生物天然免疫系统中，具有抗菌活性的一类小分子多肽1。世界上第一种抗菌肽天蚕素（cecropins）是20世纪70年代研究昆虫免疫系统时所发现的一类具有抗菌特性的小分子多肽。此后，人们又相继在各种动物(哺乳动物、两栖类等)以及植物2体内分离到抗菌肽，某些细菌也能产生并分泌类似的具有抗菌活性的多肽。由于这类多肽具有广谱高效杀菌活性，因而被命名为抗菌肽。随着研究工作的不断深入，人们发现某些抗菌肽还对部分真菌2、原虫3、病毒4甚至癌细胞5具有明显的杀伤作用，是一类具有重要潜在应用价值的活性物质。因此许多学者对这类活性多肽倾向于称之为antimicrobial peptides(AMP)或肽抗生素(peptide antibiotics)。阳离子抗菌肽(cationic antibacterial peptides)是植物和动物产生的一般由1250个氨基酸残基组成的阳离子型(含过多的赖氨酸和精氨酸 )的两亲性分子。其在广义上是指存在于生物体内具有抵抗外界微生物侵害、消除体内突变细胞的一类小分子阳离子多肽6。目前为止，世界上已知的抗菌肽共有1200多种7,8。意大利的里雅斯特(Trieste)大学的抗菌肽数据库(www.bbcm.univ.trieste.it/tossi/pag1.htm)总共收录了895种抗菌肽。据统计，在所发现的抗菌肽中绝大多数为阳离子型抗菌肽，有近700种阳离子抗菌肽，而以天然阳离子抗菌肽作模板进行人工合成的模拟肽有数千种9。1阳离子抗菌肽的理化性质 抗菌肽的理化性质现已基本清楚，主要有以下几点：1) 相对分子质量小(4kD左右)，氨基酸组成约1545个 ；2) 热稳定性高。100 加热1015 min，仍能保持一定的活力；3) 水溶性好；4) 等电点大于7，一般在8. 910. 7之间，具有较强的阳离子特征； 5) 对较高或较低的pH和较大的离子强度都有较好的抗性；6) 具有两亲-螺旋和(或)两亲-折叠结构6。有些阳离子抗菌肽在121、1.5105Pa的高温高压下处理 30min仍能保持原有活性，说明抗菌肽具有热稳定性。阳离子抗菌肽在较大的离子强度和较低或较高的pH值下仍可保持较强的活性。此外，部分阳离子抗菌肽还有抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的能力6。2阳离子抗菌肽的结构特点抗菌肽具有广谱抗菌和其他优良的特性，与它自身的结构特点密不可分。虽然抗菌肽种类繁多，来源不同，但它们的一级结构(即氨基酸序列) 具有较强的保守性，主要有以下几个特点： N端多富含碱性氨基酸(如Lys和Arg)，呈强碱性，含过剩的正电荷，使抗菌肽呈阳离子特性； 绝大多数抗菌肽的第二位氨基酸残基是Trp，它对抗菌肽杀菌活性的高低起着至关重要的作用； C端通常酰胺化，呈中型疏水性，富含Ala、Val、Gly等非极性氨基酸，可能与抗菌肽的广谱抗菌活性有关； 抗菌肽中间富含Pro，直接影响抗菌肽的杀菌活性。抗菌肽的二级结构是其攻击病原体的关键。在一定条件下，其N端易形成-螺旋，中间易形成-折叠，这样就使抗菌肽具有两亲性，易于对病原体及病灶细胞的膜进行攻击。除了-螺旋和-折叠肽外，还有许多抗菌肽存在，对其结构了解甚少。如革兰氏阳性菌产生的一些阳离子抗菌肽(如乳链菌肽)只含有2个-螺旋结构；Trabi等从猕猴的白细胞中发现由18个氨基酸组成的环肽RTD-1是一个延伸的-发夹构型10。2阳离子抗菌肽的分类阳离子抗菌肽从结构特征上可分为-螺旋肽和-折叠肽。其中-螺旋肽主要包括杀菌肽类、爪蟾抗菌肽(magainin)、cathelindin等1113；还有一些结合脂多糖的 -螺旋肽，如来源于兔粒细胞中的脂多糖结合蛋白CAP1814。 -折叠肽来源于许多动物和植物中，与-螺旋肽相比，其结构相对复杂，不同肽的-折叠程度差别较大，且许多-折叠肽中含有-螺旋单元。-折叠肽主要包括哺乳动物和防御素、植物防御素、昆虫防御素、富含脯氨酸的抗菌肽等；其他研究得较多的-折叠肽还有protegrin及tachyplesin15。3 阳离子抗菌肽的生物活性3.1阳离子抗菌肽的抗菌特点阳离子抗菌肽既可杀灭或抑制革兰氏阳性菌，又可杀灭或抑制革兰氏阴性菌，其广谱抗菌特性是传统抗生素所无法比拟的。与传统抗生素相比阳离子抗菌肽具有以下的特点：3.1.1广谱性：阳离子抗菌肽的抗菌谱较传统抗生素宽，传统抗生素通常只对细菌有效，而来自昆虫、猪、蛙、人等的阳离子抗菌肽既有抗革兰阳性菌和革兰氏阴性菌作用，又有抗真菌、抗病毒作用 16, 17 。阳离子抗菌肽不仅自身具有良好的抗菌活性，不同阳离子抗菌肽与传统抗生素联用，还可提高阳离子抗菌肽和传统抗生素的药物疗效，甚至拓宽传统抗生素的抗菌谱。这也是近年来对阳离子抗菌肽研究中的一个新发现18。目前，抗生素滥用导致的病原菌产生耐受力是困扰许多国家的一个难题。寻找合适的活性物质来替代抗生素是解决这一问题最有效的途径19。而阳离子抗菌肽通过中和电荷的方法与细菌细胞膜相互作用，以此穿透杀死细菌，极大地减少了细菌产生耐药性的可能。3.1.2 选择性毒性： 由于细胞膜的组成和结构，抗菌肽的结构及作用机理不一样，其对正常哺乳类动物细胞、肿瘤细胞和微生物细胞具有选择性毒性。抗菌肽不作用于高等动物细胞，这可能是由于真核生物细胞膜上有大量的胆固醇和膜蛋白，特别是胆固醇的存在，阻碍抗菌肽的疏水面插入磷脂双分子层，使细胞膜趋于稳定，所以真核细胞具有较强的抵抗阳离子抗菌肽溶解细胞的作用，从而免受损害。也可能是由于微生物与高等动物细胞膜的膜外结构的区别：高等动物细胞膜外表面的唾液酸与膜的距离有80埃，它可能与带正电荷的抗菌肽结合而阻止其接近细胞膜发挥杀伤作用20。3.1.3 高效性：阳离子抗菌肽的抑菌作用与肽及微生物的种类、抗菌肽浓度有关。阳离子抗菌肽在很低的浓度下即可抑制微生物生长，一般MIC在1100mg/ml。Nordeen Ro等曾研究了抗菌肽SB37对9种植物病原菌的抗菌活性，其细菌致死浓度在0. 14. 5mol /L之间。也可能正是抗菌肽的这种高效性，使得抗菌肽的抗菌作用是非特异性的。3.1.4 快速杀菌能力： 由于抗菌肽具有小分子的特点，可以快速合成并易于大量存储，与特异性免疫反应相比能更加迅速地对病原菌作出反应，使其成为生物机体先天性非特异性防御系统的重要组分。生物体受感染30min后感染部位的抗菌肽浓度明显提高。体外试验证明，大多数抗菌肽在510倍MIC范围内，5min即能杀死99.7的微生物32。3.2 阳离子抗菌肽的作用特点：阳离子抗菌肽一般热稳定、水溶性好、杀菌力强、抗菌谱广，对细菌、真菌、病毒、肿瘤细胞均有明显的杀伤作用，而对正常细胞无伤害作用，且极少有耐药菌株产生。 肽的来源不同，活性差别较大 哺乳动物防御素具有十分广泛的抗菌谱，除抗细菌、真菌、病毒外，还对支原体、衣原体、螺旋体及一些活性细胞（如肿瘤细胞）有杀伤作用。大量研究表明，一些哺乳动物防御素还在免疫调节、激素调节及刺激伤口愈合等方面有重要作用。昆虫抗菌肽中，杀菌肽类和富含甘氨酸的抗菌肽抗菌谱较广；而昆虫防御素对革兰氏阳性菌作用强，但对革兰氏阴性菌几乎无作用；富含脯氨酸的抗菌肽主要对革兰氏阴性菌有活性，而对革兰氏阳性菌则无作用。植物防御素一般具有一定的抗真菌活性和较高的抗细菌活性。 肽的作用对象不同活性不同 阳离子抗菌肽 XPF和 PGLa 21,22作用于铜绿假单胞菌时，PGLa 的活性比 XPF 强45倍；而作用于假丝酵母时，XPF的活性比 PGLa 强22. 5倍21。 同一种抗菌肽的不同结构形式活性不同 环状阳离子小肽 RTD21 和其开环类似物oRTD-1 在水中的结构非常相似，但前者的活性是后者的3倍10。 阳离子抗菌肽之间以及抗菌肽和传统抗生素之间都存在协同作用前者如抗菌肽 PGLa 同爪蟾抗菌肽或爪蟾抗菌肽以1：1联用，则抗菌活性提高250倍，但联用后增加了溶血活性；后者如抗菌肽和头孢匹罗在治疗铜绿假单胞菌感染中具有协同作用。但并不是所有抗菌肽之间或抗菌肽与传统抗生素之间都存在着协同作用，Ulvate等设计了5种不同的短肽(618个氨基酸残基)，当与红霉素或利福平联合对大肠埃希氏菌具有协同作用，而对金黄色葡萄球菌无协同作用，且这5种短肽和PGLa联合应用也无协同作用18。4 抗菌肽的作用机理及影响因素4.1 抗菌肽的作用机理4.1.1 -螺旋型抗菌肽 一般认为，阳离子抗菌肽和细菌细胞膜通过静电作用相结合后穿孔，形成离子通道，引起细胞内水溶性物质大量渗出，胞内三磷酸腺苷(ATP)下降，细胞呼吸受阻并导致细菌死亡。阳离子抗菌肽可通过电荷间的相互作用与细胞膜外层结构结合。革兰氏阴性菌的细胞外膜含有带负电荷的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，阳离子抗菌肽可取代结合在 LPS上的Mg2 +、Ca2 +等二价阳离子，引起外膜破裂或穿孔从而透过外膜33。透过外膜的阳离子抗菌肽和细胞内膜上带负电荷的磷脂通过静电引力结合，在细胞膜上形成空洞或临时通道，从而引起细胞膜崩解或透过细胞膜6。阳离子抗菌肽分子的结构特征是保证上述机制发挥作用的重要基础。其杀菌过程为：-螺旋肽通过两亲性的-螺旋上的正电荷与细菌细胞膜磷脂分子的负电荷之间的静电吸引而结合在细胞膜上，并借助于疏水段分子中连接结构的柔性插入到细胞膜中，最终通过膜内分子间的相互位移使抗菌肽分子相互聚集形成离子通道，使细菌失去膜势，不能保持正常的渗透压而死亡。4.1.2 -折叠型抗菌肽有关-折叠肽作用机制的研究报道相对较少，一般认为也是肽和细胞膜结合后，结构发生变化所致。Aumelas 等应用核磁共振对来源于猪细胞的-折叠肽 tachyplesin 进行了研究 , tachyplesin在溶液中呈反向平行的-折叠结构，其三维结构明显地存在疏水化和亲水化现象，tachyplesin易与酸性磷脂反应，尤其是磷脂酰甘油，但不能与磷脂酰胆碱反应，表明可能是带正电荷的精氨酸(Arg)侧链在与膜反应中发挥了积极作用。Kini和Fvaus等进一步研究后认为，抗菌肽是通过与膜间的静电和疏水作用来完成的。不同肽的比较表明，阳离子位点和疏水位点的立体靠近是阳离子抗菌肽抗菌活性的结构需要，也是许多抗菌肽共有的结构特点23。-折叠肽如哺乳动物防御素，其杀菌机理类似于Cecropins在膜上形成离子通道，即离子通道在抗菌活性中起着重要作用。亦有人提出假设，认为一些抗菌肽分子作用于细胞膜蛋白引起凝集、失活及离子通道的破坏，导致膜的通透性改变而使细菌死亡。另有人提出有些抗菌肽分子(如PR-39)通过影响细胞膜上的能量转运和代谢，从而损伤细胞呼吸链的功能而杀死细菌30。抗菌肽还可以断裂癌细胞的核 DNA，通过抑制DNA的合成而杀死癌细胞31。总而言之，抗菌肽作用机理的关键在于通过物理方式和细胞膜发生作用，不同类别的抗菌肽其作用机理可能不同。4.2 影响抗菌肽和细胞膜结合及形成离子通道的因素(1) 不同的阳离子抗菌肽在细胞膜上形成孔的能力差别较大。环肽细菌素(bactenecin)在最低抑菌浓度(MIC)时不能形成穿孔，而短杆菌肽在低于MIC时就能最大限度地形成孔24。 (2) pH对孔的形成有较大影响。pH为中性时，阳离子抗菌肽和膜的结合能力最强，且pH是抗菌肽溶解脂粒能力的主要决定因素25。 (3)只有当抗菌肽的浓度足够时才能形成离子通道。用抗菌肽和模拟脂质体(磷脂酰胆碱：磷脂酰甘油=3:1)试验时发现，只有当抗菌肽和磷脂的摩尔数之比大于0. 017时，才能观察到膜泄漏的产生。(4)增加介质的离子强度或降低温度也可以阻止孔的形成，从而使抗菌肽的抗菌活性下降。4.3 阳离子抗菌肽抗菌活性和抗菌谱的影响因素有关抗菌肽抗菌活性和抗菌谱的影响因素的报道较少。Oh等认为阳离子抗菌肽的转录活性同它们的MIC及它们和膜磷脂的交换能力直接相关26。阳离子抗菌肽的转录活性在被感染后能至少维持 21d，血淋巴中抗菌肽的水平可达45mol/L27。Raj等的研究表明，不同防御素的三维结构都是同样的两亲性-折叠结构，其N端和C端残基形成的平面决定了其抗菌潜力和抗菌谱，若进一步提高结构的两亲性，抗菌活性将进一步提高28。且所带阳离子较多的-防御素，可抗不具代谢活性的靶细胞；所带阳离子较少的-防御素，对代谢旺盛的目标更具活性。对阳离子抗菌肽的作用机制，许多人提出了不同的见解，如 Fridrich等通过对细胞膜的穿孔机制和杀菌动力进行研究，发现在当有 90% 或甚至更多的细菌被杀死后，膜孔的形成仍不完全。据此他们认为肽的作用机制变化多端，细胞膜渗透性增加不是唯一的作用机制29。总之，阳离子抗菌肽的作用靶位是细菌细胞膜，以及阳离子抗菌肽的作用结果是导致细菌细胞膜通透性增大等基本内容是确切无疑的。5 阳离子抗菌肽的构效关系研究阳离子抗菌肽的构效关系对于人工设计新的抗菌肽分子有着重要的指导作用。研究认为抗菌肽的功能与其自身结构、细胞膜性质有关。5.1 细胞膜的结构与组成阳离子抗菌肽只有与细胞膜结合才能引起其破损或渗透到细胞质中阻止生物大分子的合成，细胞膜的组成对阳离子抗菌肽的活性和选择性毒性有直接的影响。原核生物和真核生物细胞膜的磷脂种类、所带电荷不同，阳离子抗菌肽对其亲和力也不同。真核生物中由于存在蛋白质和固醇类物质，细胞膜的流动性低于原核生物，使阳离子抗菌肽具有选择性毒性。脂质膜实验证明，降低膜的LPS含量可减轻抗菌肽对膜的破坏。有些微生物可以通过对磷脂的修饰而对抗菌肽产生抗药性35。这些都说明膜的组分、磷脂的带电性质、脂肪链长度均可影响阳离子抗菌肽的活性。阳离子抗菌肽必须通过细胞膜的外部结构才能和细胞膜接触。革兰阳性和阴性菌细胞内膜结构类似，但后者外膜是由LPS组成，而前者的细胞壁以肽聚糖为主要成分，有些抗菌肽可对它们产生选择性毒性。在哺乳类动物细胞的外层，含有由糖脂和糖蛋白组成的糖复合物。一方面起到物理屏障的作用，另一方面抗菌肽和糖复合物结合后不易释放，从而无法进攻细胞膜，这也是抗菌肽具选择性毒性的原因之一36。5.2 肽链长度阳离子抗菌肽链的长度一直被认为是主要的影响因素。起初认为要形成横跨膜的通道，最少应含20个氨基酸残基，其后发现有些抗菌肽仅由12个氨基酸残基组成。通过对肽的N-端或C-端进行酶解，发现不同的肽在不同部位功能也是相异的。这可能是因为肽链长度的改变影响了抗菌肽的疏水性、二级结构以及在水溶液和细胞膜上的状态，从而改变了抗菌肽对膜的结合能力37。5.3 电荷阳离子抗菌肽的电荷可直接影响其活性与选择性毒性。可通过改变肽链长度、取代肽链中Arg和Lys、C-端酰胺化和增加酸性氨基酸等方法合成模拟肽，并研究电荷对其活性的影响。当阳离子抗菌肽的电荷小于5时，抗菌性随正电荷数增加而增加；当电荷大于7 时，增加正电荷对活性影响不大38。Park等39在研究parasin的功能时证实了这一点，结果显示正电荷数不但影响抗菌肽的二级结构和亲水性，同时还改变了抗菌肽的三级结构、在水溶液和细胞膜上的存在形态。另外，不改变分子中电荷数量仅改变Arg、Lys在分子中的位置时，抗菌性也受影响。Charlotte M等在研究Granulysin家族时证实了这一点，结果显示若把Granf-2中所有的Arg残基改成Lys残基，结果活性减低了两倍；若把Granf-2的N端的Arg残基替换成Lys残基，结果活性也有所降低34。电荷对肽单体或多聚体的潜在影响可能包括螺旋结构的稳定化和去稳定化作用40。5.4 疏水作用抗菌肽含有约50的疏水氨基酸残基，其所具活性是亲水基团和疏水基团相互作用的结果。疏水作用对其活性的影响是通过改变肽链中Leu、Ile、Val数量进行的。研究发现：增加分子的疏水性，抗菌肽的抗菌活力和对哺乳类动物细胞的毒性同时增加。这是由于疏水基团在抗菌肽插入细胞膜的过程中起关键作用。另外，由于疏水基团的存在，肽链在溶液中可以通过疏水作用形成多聚体，增加了对真核细胞膜的亲和力；同时也增加了抗菌肽形成两亲-螺旋的能力，而-螺旋的增加也提高了抗菌肽的稳定性41。5.5 二级结构因素两亲结构对抗菌肽保持活性十分必要，对大多数肽而言，两亲结构的破坏与螺旋的丧失会引起活性的丧失。构效关系的研究表明，抗菌肽必须具备两亲结构和正电荷，因此可利用这一原则来设计具有抗菌活性的肽42。6 抗菌肽的应用现状、存在问题及前景6.1应用现况 由于天然抗菌肽具有抗细菌、真菌、病毒和肿瘤细胞而不破坏人体正常细胞的特殊功效，如能很好地开发利用，有望给临床医学、临床药学、食品加工、动物和植物转基因技术等领域带来广阔的开发利用前景。不同种类抗菌肽其抗菌活性和抗菌谱既有相似之处，也存在很大的差异，因此寻找高效广谱的生物抗菌肽，一直是广大临床医生和科研工作者努力的方向。在临床上，抗菌肽可用于治疗外伤感染、褥疮和不宜用抗生素的感染性患者。美国的Helix BioMedix公司正在对天蚕抗菌肽的突变体 cytoporins进行临床应用研究。加拿大的lntraBiotics公司利用从蚕或牛分离到的protegrin 1开发出一种抗细菌和真菌的isegananHCL oral solution，通过喷雾用于呼吸道感染及口腔粘膜炎的治疗，取得了较为满意的疗效43。在局部感染方面 ,已进入临床试验阶段的抗菌肽有乳链菌肽、源于马盖宁的 MSI 278及源于猪protegrin的IB2367。其中 MSI 278已进入 期临床试验阶段。近年来还发现，乳链菌肽的作用位点与万古霉素的作用位点相同，暗示着乳链菌肽有可能成为万古霉素的替代品46。在系统感染治疗方面，BPI是人中性粒细胞抗菌蛋白的衍生物，它作为一种注射药物已进入期临床试验，对脑膜炎奈瑟球菌疗效特别显著，试验过程中发现经此药物治疗的儿童患者的死亡率显著降低47。在动植物转基因工程的研究中，美国路易斯安纳州大学的Jaynes 实验室与国际马铃薯中心的Dodds合作