不同品种茯砖茶中优势微生物的分离鉴定.doc

不同品种茯砖茶中优势微生物的分离鉴定胡治远1，赵运林2*，刘石泉2，彭晓赟2，李燕子2，龙立平2(1.湖南农业大学食品科技学院，湖南省，长沙市，410128；2.湖南城市学院化学与环境工程学院，湖南省，益阳市，413000；3.湖南农业大学生物科学与技术学院，湖南长沙，410128）摘 要：从湖南地区采集的18个不同品种茯砖茶样品，采用稀释平板法分离得到18株优势菌，观察其平板形态特征与生长特征，以及在电镜下有性与无性生殖结构等特点，初步确定其中15株优势菌为散囊菌属：8株冠突散囊菌（Eurotium cristatum）、3株谢瓦散囊菌（Eurotium chevalieri）、2株肋状散囊菌（Eurotium costiforme）、1株阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）和1株蜡叶散囊菌（Eurotium herbariorum）；还有3株非散囊菌属优势菌为黑曲霉（Aspergillus niger）。实验结果表明茯砖茶中优势微生物存在较大差异。关键词：茯砖茶；优势微生物；平板形态；电镜特征；鉴定分类Isolation and identification of dominant microorganisms from different kinds of Hunan Fuzhuan teaHU Zhi-yuan1，ZHAO Yun-lin2,*，LIU Shi-quan2，PENG Xiao-yun2，LONG Li-ping2 (1. College of Chemistry and Environment Engineering, Hunan City University, Hunan Yiyang, 413000, China; 2. College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;3.College of Bioscience and Biotechnology，Changsha 410128，China)Abstract：Using the flat diluted sample separation method, 18 dominant microbe were separated from the 18 different kinds of Hunan brick tea. Based on the morphological and growth characteristics in flat culture medium, sexual and asexual reproductive structure features in electron microscope, the separated 15 dominant strains were identified as Eurotium (8 Eurotium cristatum strains, 3 Eurotium chevalieri strains, 2 Eurotium costiforme strains, 1 Eurotium amstelodami strain, 1 Eurotium herbariorum strain), other isolated3 dominant strains were ascertained to be Aspergillus niger. Results showed that there was obvious difference in dominant microbe were separated from Hunan brick tea.Key words：brick tea; dominant microbe; flat shape; electron microscope features; identification classification. 1 引言茯砖茶约在1860年前后问世1，茯茶早期称“湖茶”；又因其功效类似于土茯苓，“茯茶”之名便来源于此，又因原料送到径阳筑制，故还被称为“径阳砖”。茯砖茶主销中国西北边疆少数民族地区，耐贮藏，便于长途运输。数百年来，茯砖茶以其独特的、不可替代的作用和功效，与奶、肉并列，成为西北各族人民的生活必需品2。微生物在茯砖茶的品质形成中，起着不可代替的作用3，历来学者对茯砖茶中微生物的种名、生长特性及生物学特征均进行过一定的研究4-10，但对于不同品种茯砖茶中占主导作用微生物的研究并不够全面，各种优势微生物与茶叶品质的关系研究也少见于报道。目前我国茯砖茶产业尚缺乏规范，不少劣质产品充斥着市场，消费者缺乏对产品发花实质的认识，部分消费者甚至误将发霉的砖茶当做“发花”良好，尤其是近期研究发现不同品种茯砖茶中“金花”颜色，颗粒大小存在着一定的差异11。因此，对不同品种茯砖茶中微生物进行系统性的研究，促进黑茶市场统一标准的建立已迫在眉睫。本研究选取湖南地区较具代表性的茯砖茶作为样品，分离纯化其中优势菌，基于微生物经典鉴定法12-13对它们进行分类鉴定，以期为研究微生物与茶叶品质形成的规律提供理论基础。2 材料与方法 2.1实验材料2.1.1 茯砖样本来源从湖南黑茶市场购得较具代表性的茯砖茶18种（来自11个茯砖茶生产厂家），于阴凉避光处保存（表1）。表1 供试用茶样及来源Table1 The tea samples and their sources样品编号样品名称样品生产厂家样品规格A1湘益五十周年纪念茯茶湖南益阳茶厂有限公司1000gA2湘益牌荷香茯砖湖南益阳茶厂有限公司800gA3金湘益茯砖湖南益阳茶厂有限公司450gB1临湘茶厂茯砖茶湖南临湘茶厂500gC1久扬黑茶湖南久扬茶叶有限公司400gC2乐茯速饮金花散茶湖南久扬茶业有限公司50gD1白沙溪茯茶湖南白沙溪茶厂338gD2白沙溪礼品茯砖湖南白沙溪茶厂2000gD3安化茯砖湖南白沙溪茶厂300gD4白沙溪天茯湖南白沙溪茶厂400gE1永泰福手工茯砖湖南永泰福砖茶厂350gE21979年产永泰福老茯茶湖南永泰福砖茶厂200gF1利源隆茯砖湖南利源隆茶厂600gG1黑茶园生活茯砖湖南省安化茶厂700gH1一品醇香茶湖南益阳黑茶研究所280gI1晋丰厚金花千两茶湖南省安化晋丰厚茶行420gJ1永巨贡砖湖南永巨茶叶有限公司400gK1湘叶牌特制茯砖茶益阳华茗茶厂500g2.1.2培养基基础培养基：根据对文献的查阅可知茯砖茶内部环境适合霉菌生长，选择PDA培养基，察氏培养基作为优势菌分离用培养基。鉴定培养基，参考Raper14专著以及Samson15-16等有关文献进行培养基选择：察氏培养基，20蔗糖察氏培养基（含蔗糖20，在文中简称为C20）。2.2实验方法2.2.1 茶叶样品的稀释平板培养将各个茶叶样品用粉碎机粉碎，称取粉碎后的样品25g，放置在含225ml无菌生理水与玻璃珠的500ml三角瓶内，盖上封口膜，在振荡仪上200r/min振摇30min，使其中微生物充分分散，制成10-1倍样品稀释液。在超净工作台上依次梯度稀释至10-6，取1mL10-310-6稀释度的稀释液涂布于察氏平板上并用涂布器涂布均匀，每个稀释度各设置五个重复，放置在恒温箱内28倒置培养。从培养的第三天起观察平板上的菌落，并用微生物计数法计算其在茶叶中的含量17（cfu/g干样），将数量最多的微生物确认为该茶样中的优势微生物。2.2.2优势菌的分离纯化与保存选择生长状况合适的平板，用接种针挑取优势菌菌落，于察氏培养基上进行划线分离，这样反复34次后获得纯培养的菌株，转接斜面管，将其编号后置4冰箱内保存。2.2.3 优势菌的形态学观察取4保存的金花菌株在常温下复苏24h后，转接于察氏平板与C20平板上，置于恒温培养箱内28静置培养，每天观察菌落的生长情况并作好记录。2.2.6优势菌的扫描电镜观察挑取察氏平板上生长到适宜大小的菌落制成标本并固定，常规法制片后，在扫描电子显微镜（由日立电子株式会社生产，型号JSM-6380LV）下观察其菌丝、闭囊壳、子囊、子囊孢子、分生孢子头等的形态并拍照。3 结果与分析依据各个菌株在平板上的形态特征（图1），电镜下分生孢子头（图2）、分生孢子以及子囊孢子（图3）、闭囊壳等结构特征的不同将20株优势微生物分为6类（优势菌的编号均采用来源茶叶样品的小写编号代替）：c1、c3、j1为近似菌株，在察氏平板上生长速度非常快，7d时菌落直径为5570mm，质地丝绒状，菌落正面为黑褐色，反面呈黄色，产生大量分生孢子。其电镜下特征为：无闭囊壳结构，分生孢子头为球形，直径250400um，分生孢子梗发生于基质，外壁光滑；分生孢子球形，直径35um，壁粗糙，具不规则的纵向条纹。a1、a2、a3、c2、d3、e1、f1、g1为近似菌株，7d时菌落直径在2228mm之间，大部分为圆形或椭圆形，也有不规则的存在，菌落中央厚度略高于边缘，结构较致密，边缘呈橄榄黄色，往中央颜色逐渐加深，中央部分颜色为橄榄褐色，生长时间较长的部位有少许黑褐色香油状渗出液，菌落周围的培养基亦被色素染成茶褐色，以闭囊壳为主，菌落边缘可见少量灰绿色分生孢子头。菌落反面为深黄至棕色。其电镜下特征为：闭囊壳为球形或近球形，直径100180um；子囊为球形，1014um；子囊孢子呈双凸镜形，有两个明显的纵向鸡冠状突起，孢子体大小为56um45um，凸面比较粗糙，具尖疣；分生孢子头呈疏松放射形，孢子梗生自基质，直径为59um，壁光滑；顶囊近球形或烧瓶形，直径1225um；瓶梗6.510um2.53.4um，着生于顶囊上半部；分生孢子为椭圆形，45um34um，孢子壁粗糙，具小刺。a4、i1为近似菌株，其菌落生长速度较快，7d时直径达3542mm，颜色为米黄色，随培养时间增长颜色略有加深，大量浅黄色菌丝呈辐射状由中央向四周分布，分生孢子头为灰绿色，在分布上以菌落周围多于中央，在菌丝中可观察到大量蜡黄色闭囊壳，基本不产生渗出液，菌落反面为黄色。其电镜下特征为：闭囊壳为球形或近球形，直径100140um；子囊为球形或近球形，直径1417um；子囊孢子呈双凸镜形，5.56.5um4.85.5um，有两个明显的“赤道”冠，宽约0.6um，凸面有不规则网结的肋状突起；分生孢子头生于菌丝，孢梗茎直径为812um，壁光滑，顶囊球形或近球形，直径2030um；分生孢子为椭圆形，大小3.55um34.5um，孢子壁具小刺。b1菌落生长速度较快，7d时直径为3640mm，菌落厚度较薄，具不规则皱纹；闭囊壳呈亮黄色，分布以中央为主，分生孢子较多，暗灰绿色，有少量渗出液，菌落反面为黄色，亦可见不规则皱纹。其电镜下特征为：闭囊壳为近球形，直径80160um；子囊孢子呈双凸镜形，4.65.5um3.54um，孢子两瓣中间具沟，有不规则的脊，凸面粗糙；分生孢子头呈疏松短柱形，110180um；分生孢子梗直径811um，壁光滑；顶囊为烧瓶形；分生孢子为园球形，45um，孢子壁具小刺。b2、d2、k1为近似菌株，在20蔗糖察氏平板上7d时菌落直径为2530mm，总体厚度一致，具不明显的辐射状沟纹；菌落中心颜色为深黄色，往周围颜色逐渐变淡，菌落反面深黄至棕色。其电镜下特征为：闭囊壳为球形，直径120160um，子囊近球形，710um；子囊孢子呈双凸镜形，45um34um，“赤道”部分具鸡冠状突起，凸面有小的突起；分生孢子头球形至辐射形，145240um；孢子梗生于基质或气生菌丝，孢梗茎直径为7.014um，壁光滑；顶囊为烧瓶形，孢梗茎顶端稍膨大；分生孢子为球形，45um2.53.5um，孢子壁具小刺。c4在20蔗糖察氏平板上生长速度较慢，7d时直径为1823mm，颜色为灰绿色至黄褐色，菌落周围产生较多的灰绿色分生孢子，中央以闭囊壳为主，菌落反面为近红褐色。其电镜下特征为：闭囊壳为近球形，100180um；子囊为球形，1216um；子囊孢子呈双凸镜形，6.57.5m45.5um，赤道部位具明显但较浅的沟，两侧有较低的脊，凸面光滑；分生孢子头呈扫帚形，孢梗直径816um，外表光滑；顶囊椭圆形，2548um；分生孢子为椭圆形，56um79um，孢子壁具小刺。表2 不同茶叶样品中优势微生物的种类及含量（cfu/g干样）Table 2 Different tea samples of advantage of microbial kind and content (cfu/g dry kind) 茶样编号优势菌种类含量茶样编号优势菌种类含量A1冠突散囊菌2.8106D4蜡叶散囊菌2.0105A2冠突散囊菌9.3105E1谢瓦散囊菌7.0103A3冠突散囊菌1.9106E2冠突散囊菌8.0104B1肋状散囊菌3.8104F1冠突散囊菌4.1105C1阿姆斯特丹散囊菌1.2105G1冠突散囊菌5.6104C2谢瓦散囊菌1.0106H1冠突散囊菌6.2105D1黑曲霉2.0105I1肋状散囊菌5.0104D2冠突散囊菌2.8104J1黑曲霉4.8104D3黑曲霉1.75105K1谢瓦散囊菌7.2105图1 部分优势菌（散囊菌属）在C20培养基平板上生长7d时的照片1.a1；2.a2；3.a3；4.b1；5.c1；6.c2；7.d2；8.d4；9.e1；10.e2；11.f1；12g1；13.h1；14.i1；15.k1Figure 1 part advantage bacterium (of) in scattered capsule bacteria C20 medium plate to grow on 7 d of photograph1.a1；2.a2；3.a3；4.b1；5.c1；6.c2；7.d2；8.d4；9.e1；10.e2；11.f1；12g1；13.h1；14.i1；15.k1图2 部分优势菌（散囊菌属）电镜下分生孢子头照片1.a1；2.a2；3.a3；4.b1；5.c1；6.c2；7.d2；8.d4；9.e1；10.e2；11.f1；12g1；13.h1；14.i1；15.k1Figure 2 parts scattered advantage bacterium (sac) by electron microscopy of bacteria conidium head photos 1.a1；2.a2；3.a3；4.b1；5.c1；6.c2；7.d2；8.d4；9.e1；10.e2；11.f1；12g1；13.h1；14.i1；15.k1图3 部分优势菌（散囊菌属）电镜下子囊孢子照片1.a1；2.a2；3.a3；4.b1；5.c1；6.c2；7.d2；8.d4；9.e1；10.e2；11.f1；12g1；13.h1；14.i1；15.k1Figure 3 parts scattered advantage bacterium (sac) by electron microscopy of bacteria ascospore one photo 1.a1；2.a2；3.a3；4.b1；5.c1；6.c2；7.d2；8.d4；9.e1；10.e2；11.f1；12g1；13.h1；14.i1；15.k1依据微生物的经典鉴定法12-13，得到以上20个菌株的鉴定结果：d1、d3、j1为：黑曲霉Aspergillus niger；a1、a2、a3、d2、e2、f1、g1、h1为：冠突散囊菌Eurotium cristatum，无性型名称：小冠曲霉,Aspergillus cristatellus；b1、i1为：肋状散囊菌Eurotium costiforme，无性型名称：肋状曲霉,Aspergillus costiformis；c1为：阿姆斯特丹散囊菌Eurotium amstelodami，无性型名称：葡萄曲霉，Aspergillus vitis；c2、e1、k1为：谢瓦散囊菌Eurotium chevalieri，无性型名称：谢瓦曲霉,Aspergillus cheualieri；d4为：蜡叶散囊菌Eurotium herbariorum，无性型名称：灰绿曲霉,Aspergillus glaucus。4 讨 论实验结果表明18个湖南茯砖茶样品中的优势微生物包括3株黑曲霉、8株冠突散囊菌、3株谢瓦散囊菌、2株肋状散囊菌、1株阿姆斯特丹散囊菌和1株蜡叶散囊菌。其中有15个为散囊菌属（Eurotium Link），这说明散囊菌在不同的茯砖茶中普遍存在且占主导地位。除了已被之前研究者们证明了的茯砖茶发花微生物冠突散囊菌，其他散囊菌如谢瓦散囊菌、阿姆斯特丹散囊菌和肋状散囊菌在茶叶中也有较高的含量甚至占据主导地位，而且大多数培养特征为金黄色或近黄色，据此可认为，茯砖茶内的“金花”，除了由冠突散囊菌繁殖产生外，还有一部分是由其他散囊菌产生的。尤其值得注意的，茶样E2为永泰福茶厂1979年生产的老茯砖，经过三十多年的放置后，仍然从中成功分离出了冠突散囊菌（菌株e2，在茶叶中含量为8.0104cfu/g），这说明冠突散囊菌的孢子在干燥和几乎无营养的条件下，可以进行长达数十年的休眠，这与温琼英等对冠突散囊菌孢子耐受能力的描述相一致18。茶样H1为湖南益阳黑茶研究所生产的一品醇香茶，研究所采取与传统技术路线不同的调控发花手段，所接种的原始菌株由茶样A3（金湘益茯砖茶）中分离获得，经过多次继代培养后，两种茯砖茶在“金花”颗粒大小、色泽，以及茶叶菌花香气等方面存在着一定的差异，曾被怀疑优势菌是否还是原来的金花菌，根据平板培养与电镜观察的结果，两个菌株在形态特征上基本一致，说明该菌株作为生产用菌种具备遗传上的稳定性。茶样D1、D3、J1中的优势微生物均为黑曲霉，这在成品茯砖茶中应属于不正常的现象，黑曲霉在茯砖茶的渥堆时期曾经大量存在并对茶叶品质有着初步改善作用19，但经过气蒸和压制进入发花阶段后，喜湿的黑曲霉理应“让位”给耐干燥的散囊菌属，正常的茯砖茶成品内黑曲霉含量应在103cfu/g以下。使黑曲霉在茯砖茶内占优势地位的主要原因是由于对烘房环境调控欠佳，湿度过高导致黑曲霉大量生长。黑曲霉生长较多的茶叶霉味较重且香气不足，严重影响了产品品质。由表2可知，不同的茯砖茶中优势菌含量差别较大，从最高的2.8106cfu/g到最低的7.0103cfu/g，这说明市场上的茯砖茶发花质量不够稳定，即便是同一家茯砖茶企业生产的产品，其中微生物的种群含量也可能相差较大（如发花的样品D1与未发花的样品D2皆为湖南白沙溪茶厂的产品）。因此，对传统的茯茶生产工艺进行改良，提高产品发花质量是保证茯茶市场活力的重要方面。茶叶中检出的非优势微生物主要还包括产紫青霉、橘灰青霉、毛霉等，有6样品份检出产紫青霉；9份检出橘灰青霉；4份检出毛霉，由此说明湖南地区茯砖茶中微生物具备多样性，各种优势非优势微生物对茯砖茶品质形成的影响和它们相互之间的作用还需要进一步研究。参考文献：1 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