蓝藻钙信号.doc

蓝藻钙信号钙离子作为简单的二价阳离子，广泛参与动物、植物和微生物的各种复杂的生命过程，如肌肉收缩、神经传导、细胞分泌、受精、个体发育、细胞凋亡及对外界各种刺激的应答等，是分布最广泛，也是最重要的细胞内第二信使。钙离子之所以具有如此复杂的生理功能，关键在于细胞能够产生多种多样的、高度特异性的钙信号1-4。阐明一个如此简单的钙离子如何有序地精细调节一个细胞内各种不同的的生理过程，对重要生命现象的研究具有重要意义2,5。理解钙信号的简单性与复杂性的统一也将对认识整个细胞的信号转导具有启迪与指导的意义2。钙信号在真核生物中的作用很早就得到明确，关于钙信号的发生、编码和解码机制是近年来国内外研究的热点6-10。人、动物和植物中的研究表明，特异性钙信号的产生是通过胞质自由钙离子的浓度变化来实现的，位于质膜及细胞内膜上的钙离子通道、钙泵及 Ca/H反向转运蛋白参与这一过程6,11。细胞受到刺激时，钙离子通道的开放使得胞外或胞内的钙离子进入到胞质中，使胞质钙离子浓度升高，而钙泵或Ca/H反向转运蛋白的作用是将钙离子运出胞质，使得胞质钙离子浓度下降。由于这种变化的幅度、持续时间、频率及其在细胞中分布的不同，从而形成复杂的钙信号系统。细胞的钙信号系统具有多尺度、多层次、非线性的时-空结构。过去20多年来，多种钙离子荧光指示剂的开发和激光共聚焦显微系统的应用，使得对活细胞钙离子浓度变化的实时检测和微区域观察成为可能。钙信号基本单元“钙火花”及其相关钙信号事件的发现，揭示了钙信号局部控制的新机制，以及细胞内精细的钙信号结构体系12-15。钙火花、钙针、钙星、钙闪烁等是钙微区的代表，构成钙信号的基本单位，它们是由于钙离子的瞬间进入造成的局部钙浓度升高，表现为空间异质性，对细胞特定区域的生理过程具有调节作用。它们的时空总和形成钙瞬变、钙波和钙振荡等全局性的钙信号8,16,17。细胞钙信号转导的数字-模拟二元特征的提出，将钙信号原理的单一性与其调控和功能的复杂性统一了起来：纳米-微米尺度上短暂的钙信号事件（数字系统）随机叠加于连续的全细胞钙信号（模拟系统）背景中。数字模式的微区域钙信号赋予细胞钙信号在时间、空间、幅度上多尺度多层次的精细结构，从而使其具备了丰富多彩的信号编码能力2。鉴于钙信号复杂的动力学特征，系统论、信息论以及工程学原理开始引入钙信号研究，特别是丰富多彩的数学模型的建立，对各种钙动力学现象的解释和特异性钙信号的编码机制的研究发挥了重要作用7,18：钙振荡是普遍存在的一种全局性细胞信号模式，具有振幅、频率等多种动力学特征。外界刺激通过钙触发的钙释放机制（CICR），使胞浆钙离子浓度升高但同时又能避免细胞持续地暴露在高钙的环境中；而外界刺激的信息，则通过钙振荡的频率、振幅、持续时间以及波宽等形式进行编码，从而调节细胞的多种生理功能10,19。特异性钙信号的解码是产生特定的生理反应的前提，细胞中的钙信号感应蛋白是执行这一任务的分子解码器，如钙调素、ATP酶、离子通道、蛋白酶、蛋白激酶、磷酸化酶等20。它们是钙结合蛋白，可通过构象改变进行信号的解码，如钙调素是真核生物中普遍存在的一种多功能钙信号感应蛋白，在受到钙信号刺激后，发生构象改变而激活，与靶酶结合而调节酶活力21；也可通过共价修饰而传递钙信号，如植物中的钙依赖蛋白激酶（CDPK），感受钙信号后发生可逆磷酸化而被激活，转而调节下游靶蛋白的磷酸化22。这些钙信号感应蛋白可通过多种机制“感应”钙信号。研究表明，许多钙调蛋白对钙振荡频率敏感，如参与信号解码的酶可通过调节速率常数和钙离子亲和力等分子参数传递不同频率的钙信号；或者振荡频率以类似共振的方式选择性激活信号蛋白9，23。与真核生物相比，钙信号在原核生物中的作用一直未得到明确24。近年来，随着研究的深入，越来越多的证据支持钙信号存在于原核生物的观点：同真核生物一样，原核生物细胞内的钙浓度也受到严格调控；也有钙离子通道、钙泵、反向转运子以及钙结合蛋白等参与钙平衡的调节，许多钙离子通道或转运蛋白在结构上与真核生物高度相似；通过生物信息学技术在多种原核生物基因组中都发现了候选的钙结合蛋白；细菌在趋化性、细胞分裂与分化、基因表达等过程中都有钙离子的参与等25-27。原核生物胞内自由钙离子浓度检测技术一度成为研究其钙信号作用的瓶颈。生物型钙离子荧光指示剂发光蛋白Aequorin、Obelin等的发现和成功应用，推动了这一技术的发展28，29。研究表明，原核生物也存在复杂的钙瞬态变化，可能也是作为一种信号机制，通过频率、幅度、持续时间以及分布的不同进行信息传递25。尽管如此，至今还不能从细胞水平直接证明特异性钙信号模式对特定生理过程的调节作用；并且由于细胞结构的不同，原核生物钙信号是否与真核生物有类似的传导机制有待进一步研究。 蓝藻是地球上最早出现的光合自养原核生物，分布广泛，在各种极端生境下都有蓝藻生存，具有高度的环境适应性，对光、温度、营养元素、酸碱度、渗透压等外界生存环境的细微变化，都会迅速产生适应性的应答反应，因此研究蓝藻信号传导途径不仅为阐明其高度的环境适应性提供了理论基础，而且具有重要的进化意义。近年来，不仅蓝藻的二元信号传导系统研究取得了重要进展，而且许多研究揭示了钙信号的存在。Torrecilla等从细胞群体水平研究表明，冷热休克、光暗转换、渗透压休克、结合氮缺乏等刺激均可引起鱼腥藻（Anabaena PCC7120）和聚球藻PCC7942钙瞬变的发生，并且钙瞬变的动力学特征（持续时间、幅度等）各不相同，表现出一定的钙信号特异性28-30。丝状蓝藻细胞在缺氮条件下发生分化，形成具有固氮功能的异形胞, 这是环境适应的表现。生物固氮研究是生命科学中的重大基础课题31。模型生物鱼腥藻PCC7120生物固氮细胞分化形成机制研究取得了很大进展，钙信号在细胞分化过程中具有不可或缺的作用29，32。结合氮缺乏时藻细胞-酮戊二酸（2-OG）水平提高，成为引发细胞分化的信号分子，全局性转录调节因子NtcA感受这一信号，调节细胞分化过程中关键分子hetR的表达。钙信号的产生是钙结合蛋白（Ccbp）调节的结果：一方面，Ccbp可被hetR降解释放钙离子；另一方面，NtcA可抑制分化细胞和异形胞中Ccbp的表达，从而使钙离子浓度高于营养细胞。氧化还原态是许多生物应对外界刺激选择性调节基因表达的机制， 而鱼腥藻的NtcA的调节作用直接受细胞氧化还原态的影响33,34。Ccbp基因的差异表达是否是该机制作用的结果，有待进一步研究。另外，尽管结合氮缺乏条件下可检测到鱼腥藻钙瞬变信号形式的存在，但实验条件下所反映的是样品中所有细胞钙离子浓度变化的平均值，反映不出丝状体细胞间的差异，也没检测到单细胞内特异性的钙信号模式，如钙振荡或空间异质性等，而这是研究钙信号作用机制的关键。再者，钙信号在细胞分化过程中否有类似真核生物的传递机制，如通过钙调素发挥作用还不清楚。以上问题的解决都有赖于对钙信号的特征、形成机制和传递机制的深入研究。本课题通过建立鱼腥藻PCC7120细胞水平的钙离子浓度检测方法，对不同生理条件下藻细胞钙离子浓度变化的幅度、频率、持续时间以及亚细胞分布进行检测，分析钙信号的特异性，建立“钙签名”；分析钙离子通道、钙泵、钙结合蛋白以及活性氧在钙信号发生中的作用；结合数