脂溶性药物脂质体包封率研究进展[1].doc

综 述脂溶性药物脂质体包封率研究进展 王淑娟【摘 要】 脂质体的质量研究是脂质体研究中最为重要的一部分，其中一个重要的指标是包封率的测定。本文主要对脂溶性药物脂质体包封率测定方法及方法的可行性研究等近期研究进行了综述，并分析了现存的一些问题及适当的解决方法。为脂溶性药物脂质体的研究提供参考。【关键词】脂质体；脂溶性药物；包封率几十年来，脂质体作为新型药物载体以及生物膜模型的研究受到热切关注。这主要是基于脂质体既有亲水性又有疏水性，且作为药物载体与其他剂型相比，脂质体因其磷脂可生物降解、无毒、无免疫原性，生物相容性非常好，且结构上自我封闭，具有保护药物生物活性、有效的控制药物释放、提高稳定性、延长半衰期、提高疗效及降低药物毒副作用等诸多优点，被广泛研究，并用于动物体外和体内药物实验。很多脂溶性药物因其生物利用度低、毒性大或水中不稳定等特点，临床应用受到限制1。脂质体作为一个优良的药物载体，脂溶性药物可溶解于磷脂双分子层的夹层中，动态地增加难溶性药物的溶解度。药物的理化性质、脂质双分子层的构成及制备方法也会影响药物的溶解度2。脂溶性药物因其理化性质不同，脂质体的制备和检测方法多种多样，选择合适的制备方法和检测手段成为载药脂质体制备研究的一个重要部分。本文主要对脂溶性药物脂质体包封率测定方法及方法的可行性研究等近期研究进行了综述，并分析了现存的一些问题及适当的解决方法。为脂溶性药物脂质体的研究提供参考。 一 脂溶性药物脂质体制备方法当磷脂分散在水中形成多层囊泡，每一层都是磷脂双分子层，各层之间被水隔开，这种由脂质双分子层构成，内部为水相的闭合囊泡称为脂质体。无论何种方法制备，脂质体的形成都是由于磷脂-磷脂分子、磷脂-水分子之间亲水与疏水相互作用的结果。而引起磷脂分子重排，形成双分子层进而达到热力学平衡，最终形成脂质体的这一过程必须要有能量的供应1。传统脂质体的制备一般包括以下基本步骤： 磷脂、胆固醇等脂质及脂溶性药物先溶于有机溶剂，在一定条件下去吃出溶解脂质的有机溶剂使脂质干燥形成脂质薄膜； 使脂质分散在水溶液（或含有水溶性药物的水溶液）中水化形成脂质体。 纯化形成的脂质体。 对脂质体进行质量分析。对于脂溶性药物而言，由于脂质体膜内部是由非交联分子相互作用相关的分子组成的非常流动的脂肪族基质，它容易接受和保留大范围的脂溶性化合物而不需要任何固定点特异性化学结构。在一般正常情况下，这些化合物掺入浓度大约1%-10%（重量比）而不会严重破坏双层结构3。制备含药脂质体时,根据药物装载的机制不同可分为被动载药法与主动载药法两大类。所谓被动载药,即首先将药物溶于水相或有机相中,然后按所选择的脂质体制备方法制备含药脂质体,决定其包封率的因素为药物与磷脂膜的作用力、膜材的组成、脂质体的内水相体积、脂质体数目、分子量及药脂比等；所谓主动载药,即通过内外水相的不同离子或化合物梯度进行载药,主要有K+-Na+梯度和H+梯度（即pH梯度）等。传统上,人们采用最多的方法是被动载药法，对于脂溶性的、与磷脂膜亲和力高的药物,被动载药法较为适用4。脂溶性药物脂质体常用制备方法主要包括薄膜分散法、乙醇或乙醚注入法、有机溶剂分散法、反相蒸发法、机械匀质法、冷冻干燥法、冻融法、多相制备法、二次乳化法及表面活性剂增溶法等5。二 脂溶性药物脂质体包封率的测定方法1 离心法： 根据脂质体与游离药物比重不同所受到的离心力不同, 从而沉降速度不同, 达到分离的目的, 用来测定包封率。用离心法测定包封率分为低速离心和超速离心两种。低速离心适用于水溶性极差的药物脂质体分离，因不溶于水的药物在水相中容易形成微颗粒，使用低速离心可以将游离药物沉淀下来，而含药脂质体为纳米颗粒，不足以形成沉淀。因此使用低速离心法前，有必要对药物在水介质中溶解程度进行考察。杨瑞等人6 认为紫杉醇在水中的溶解度很低，在低速离心条件下会以沉淀形式析出，故取制备好的脂质体5 000 r/min，离心10 min ，分离后测得包封率90%。但作者并未测定游离药物在水介质中的溶解度，因此所测的包封率准确性有待考察。李琅琅等7 制备了荧光红GG脂质体，荧光红GG为水不溶性药物，作者经实验摸索确定3000rpmmin-1离心10min，离心后上清为脂质体，沉淀为游离药物，测得平均包封率为12.08%。低速离心法具有操作简便,仪器要求低等优点。 这种方法应用的前提是药物在缓冲液中的溶解度极小(小于投药量的5 %) ,脂质体足够大。且离心速度和离心时间的正确选择也很关键，离心速度过小药物沉淀不完全,离心速度过大则含药脂质体被沉淀。对于较大粒径的脂质体，低速离心法不能准确的测定其包封率。超速离心法较适用于两种情况脂质体的分离：一是制备过程投药量很小，游离的药物基本溶解或在缓冲液中呈极小纳米粒状态；二是脂质体粒径相对较大，可以被完全离下来。梅之南等8制备的固体脂质纳米粒在100-200nm之间。测定药物包封率之前，先将雷公藤内酯醇固体脂质纳米粒混悬液加1mol/L HCl调至pH约1.2,使纳米粒凝聚,然后4、50000r/min超速离心30min,上清液为游离药物，沉淀为脂质体测得最大包封率为92.3%；Qingguo Xu 9 用 hydroxyapatite羟磷石灰修饰的脂质体包裹疏水性药物，得到的脂质体粒径在200nm-400nm，采用15000 rmin-1离心10min分离游离药物和脂质体，测得最大包封率为16.8%；金圣煊等10以30000 g、4 条件下超速离心1 h来分离脂质体和游离的肉豆蔻酸酯,脂质体保持混悬状态,而游离的肉豆蔻酸酯则沉淀出来,结果测得包封率达到98%；孙晶等11制备的新型姜黄素脂质体，平均粒径97.08nm,经60000rmin-1离心1h分离脂质体和游离药物，测定包封率大于99%。作者还对分离后的沉淀和上清进行TLC分析检识磷脂，TLC结果证明上清中无脂质体，分离完全。许洁12制备的环孢素A脂质体粒径在100-200nm之间，采用超速离心法分离游离药物和脂质体，选择224000g离心60min,测得平均包封率为87.09%。超速离心法优点是操作简单，节省时间且测定结果准确。但其对设备要求高，根据不同脂质体粒径选择不同的转速，ETouitou 等13报道 150nm 的脂质囊泡，采用40000 rmin-1 ，3h 才能将脂质体和游离药物完全分离。2葡聚糖凝胶柱层析法葡聚糖凝胶柱层析，又称葡聚糖凝胶过滤，属于分子排阻色潽法，利用脂质体与游离药物分子质量和粒径大小的差异进行分离, 脂质体的平均分子量约10-30万道尔顿，较广泛地用于小分子药物脂质体的包封率的测定。常用的葡聚糖凝胶 14 有Sephadex G-50（Fractionation range 1000-30000）和Sephadex G-25（Fractionation range 1000-5000），操作程序与脱盐和分离一样，先将溶胀好的凝胶装入柱子中,用洗脱液冲洗柱子至平衡后, 将脂质体 上柱洗脱。脂质体由于粒径较大先被洗脱下来, 而游离的药物粒径较小, 穿透到凝胶的内部空隙, 较后被洗脱下来, 使得脂质体与游离药物分开。当凝胶过滤法用于分离脂溶性药物脂质体时，应保证样品中无游离药物的微晶颗粒，否则可能导致药物微晶阻塞柱子难以洗脱或随脂质体一同洗脱出来，导致测得包封率不准。陈军等15凝胶Sephadex G-50分离脂质体和游离的马钱子总生物碱。所用柱长27cm，内径1cm，ph7.4 PBS洗脱，流速1 mLmin- 1,每份2ml,收集18份，脂质体和未包封的游离药物可以实现完全分离，第1-7 管为含药脂质体，第8-16 管为游离药物。最后测得马钱子总生物碱脂质体平均包封率77%。徐昕等16 选择Sephadex G-50( 25.0 cm 0.8 cm) 分离脂质体和游离的蟾酥提取物，,以pH7.4 的PBS缓冲液洗脱,洗脱速度为1 mL min- 1 ,乳白色带接近柱口时开始收集,待其完全通过时停止收集,共约11 mL,后续液约60 mL。 HPLC测得平均包封率95.54%。值得注意的是 Polydextran beads 表面有许多位点能够与脂质体膜相互作用，可能导致脂质体小量丢失，当脂质体浓度低时，这种现象更明显。因此分离前，用适量空白脂质体预先饱和柱子，可以避免上述现象发生；当凝胶颗粒直径太小或胶床含有许多细小颗粒，较大的脂质体（0.4m）有时会停留柱内。用于MLV层析的基质颗粒在50-150m范围比细颗粒更好，而所有的各种直径颗粒凝胶都适于SUVs的层析3。高晓黎等17，用3 种不同型号的葡聚糖凝胶, 采用正交设计法, 对测定替加氟脂质体包封率的条件进行了筛选, 实验结果表明葡聚糖凝胶的径高比、洗脱流速、上样量都影响脂质体与游离药物的分离效果, 且3 种凝胶中以粒径为100300m 的Sephadex G-50 最适于脂质体包封率的测定。葡聚糖凝胶过滤法优点在于其方法简单，设备要求廉价，样品回收率佳，分离效果较好。不足之处是其耗时较长，包括预装柱、柱平衡、预饱和等多个程序，且在样品洗脱过程中，脂质体容易被稀释和遭到一定程度的破损。文扬在18吡喹酮长循环脂质体的研究中，分别采用高速离心法、微型柱离心法及葡聚糖凝胶G-50 来分离脂质体和游离药物，结果发现只有葡聚糖凝胶G-50能使两者完全分离。3 微型柱离心微型柱离心法是一种快速简便的分离脂质体内外相中小分子药物（最好小于7000）的方法，适用于样品量小,小分子渗漏较快的包封率测定。它结合了葡聚糖凝胶柱的分子筛作用和离心法的加速分离作用，同时又减小对样品的稀释程度。微柱离心法常用的凝胶有Sepha- dex G-50（Fractionation range 1000-30000）和Sephadex G-25（Fractionation range 1000-5000）。制备方法3是： 溶胀好的（至少5h）凝胶储存于4备用； 1ml注射器去芯后加入滤板防止凝胶脱落；将水化凝胶装满注射器； 将注射器装入1310mm离心管，2000rpm/min离心3min除去多余缓冲液，柱床高达0.9ml刻度线位置； 取0.2ml未稀释的样品逐滴加入到微型柱顶端，如果脂质体加的过快，柱床完整易遭到破坏造成不完全分离；2000rpm/min离心3min 收集含脂质体的洗脱液； 加入0.2ml 缓冲液漂洗微型柱，离心洗脱液中不含药物； 第二次加入0.1ml 缓冲液，离心收集游离药物测定含量。该法的可行建立于样品不被凝胶填充物物理滞留的假设之上，应事先考察游离药物及含药脂质体的回收率。Allen Zhang 19 制备了新型的低压冻干紫杉醇脂质体，粒径约150nm。采用Sephadex G-25微型柱离心法分离脂质体和游离药物，之前用100l空白脂质体预饱和柱子，1520g15 min 离心除去多余空白脂质体。上样后1520g15 min离心分离脂质体和游离药物，HPLC测定包封率，J. Allen Zhang认为Sephadex G-25微型柱对紫杉醇脂质体分离效果佳，且回收率达到100%；刘丹20 采用微柱离心法进行芹菜苏囊泡包封率的测定。取芹菜素囊泡加至经2 000 rmin- 1离心处理后的Sephadex G-50凝胶小柱中,用适量蒸馏水多次离心洗脱,收集前两管离心液,过滤后进样测定峰面积(A ) ,计算包封率最高约60%。微型柱离心法优点很多，快速简便、适用于样品量小及小分子渗漏较快的包封率测定，尤其适合乙醇注入法制备的脂质体，因其避免了原本浓度较低的脂质体溶液被再次稀释而影响样品含量的测定。其缺点在于洗脱过程也对样品产生了一定的稀释，且葡聚糖凝胶微柱离心分离脂质体受较多因素影响。不同的脂质体或药物，洗脱时间存在差异，可能造成脂质体与游离药物分离不完全。王汀21 等用微柱离心-药脂比法测定脂质体的包封率。首先用定磷法考察微柱以1 000 rmin - 1离心1 min对空白脂质体和载药脂质体的洗脱率均为30.6 % ,此时尽管载药脂质体没有全部洗脱出来，但游离药物全部留在柱内。取此洗脱下来的脂质体行药脂比测定，则测定洗脱液中的药脂比(定值) 与起始药脂比相比较即为药物包封率。试验证明,对于一些药物及一定的脂质体,若完全洗脱脂质体则无法完全去除游离药物,同时说明,葡聚糖凝胶微柱离心分离脂质体,以药脂比测定药物包封率,无需将脂质体完全洗脱,只要完全分离了游离药物,测定结果不受脂质体洗脱程度影响,只要达到药物或脂质体检测需要量即可。另外本文作者还考察了微柱离心对三种性质不同药物亲水性盐酸拓扑替康( TPT) 、亲脂性氟吡咯芬( FPF) 、亲水亲脂性酮洛芬( KPF) 、相同脂质组成的脂质体的分离。发现水溶性药物TPT 易于洗脱，随着药物脂溶性的增加，凝胶对其吸附作用增强。脂质体与凝胶体积比不宜超过0.2 ,否则很难保证脂质体与游离药物完全分离。试验中当脂质体与凝胶体积比为 0.3 时,即使是脂溶性较强的FPF ,在3 000 rmin - 1离心3 min 条件下,仍有游离药物被洗脱出。4透析法透析法是利用脂质体和药物分子大小不同, 通过半透膜材料的膜孔截留作用将游离药物与脂质体进行分离的方法。基本方法：把脂质体放在透析袋内, 再把透析袋置于比它体积大许多倍的透析介质中, 游离药物顺浓度梯度从透析袋内渗透到透析袋外, 而脂质体由于粒径较大而不能渗透到外部介质里。然后在不同的时间测定介质中的药物浓度, 直至外部药物浓度值恒定, 则说明透析袋内外游离药物的浓度达到平衡。测出此时介质中的药物浓度（即游离药物浓度）进而计算出包封率。透析法不适用于除去大分子药物，透析过程是缓慢的，在透析过程中要注意使用的透析液的渗透压与脂质体混悬液的渗透压应相同，否则，会引起脂质体的体积发生变化，导致包封的药物泄漏。李亮22采用透析法分离脂质体和游离的薏苡仁油，考察了透析时间对脂质体包封率的影响，发现透析小于16小时游离药物没有完全除去，导致所测包封率偏高。透析16小时后，脂质体开始出现药物泄漏，最终确定透析时间为16小时，测得包封率63.98%。王艳丽23测定汉防己甲素脂质体包封率前考察了葡聚糖凝胶柱层析法和透析法两种分离方法，结果葡聚糖凝胶柱层析法用于分离汉防己甲素脂质体回收率低，而透析法测定汉防己甲素脂质体的回收率较高，能准确可靠的测定汉防己甲素脂质体的包封率。杨亚军24 用透析法测定甲砜霉素脂质体包封率前，经预实验室透析过程中发现，6 h 的透析量为12 h 透析总量的96.33，说明透析6小时游离药物可基本除去。同时作者又吸取不同浓度的甲砜霉素标准液和空白脂质体于透析袋中，室温下在200 mL pH 7.4 的PBS 液中，磁力搅拌透析6 h测定平均回收率为96.12.01。预实验表明透析法可以用于甲砜霉素脂质体很好的分离。 透析法较为适用于水溶性药物脂质体与游离药物的分离。用于脂溶性药物脂质体分离时，由于其不溶于水，会影响其顺浓度梯度向外渗透，导致所测包封率不准确。因此很有必要再透析液中引入有机溶剂或其他增溶成分增加药物在透析液中的溶解度以达到“漏槽”条件，会引起脂质体内外水相产生大的差异，从而有可能导致脂质体的内外渗透压改变，引起脂质体内容物渗漏，影响包封率测定结果12。Paola Mura 等25 用透析法测定了苯佐卡因脂质体的包封率,由于苯佐卡因水溶性差，选用 水-乙醇(50 50) 溶液做透析介质,以促进游离药物渗透。 同时采用超速离心法分离脂质体和游离药物，结果透析法与离心法所测包封率相当。透析法操作简单,所用仪器方便, 透析袋价格比较便宜, 且用量较少, 比较经济。但不适合大分子化合物的操作,且所需时间较长,一般需1024 h 以上，易导致脂质体中的药物的渗漏。此外，透析外液体积远远大于内液体积,当透析完全时,脂质体周围药物浓度稀释较大倍数,使脂质体和游离药物的动态平衡被打破而导致脂质体药物的渗漏, 使测得的结果偏低。反透析法（也称内透析法）可以在一定程度克服以上缺点。将制备的脂质体放在透析袋外, 透析袋内放入透析介质, 测定不同时间透析袋内药物的浓度的方法，脂质体周围的游离药物稀释倍数较小,可以较好的避免脂质体与游离药物动态平衡被打破而导致的渗漏。黄慧学26 在白花丹素脂质体给药系统的研究中采用反渗透法分离脂质体和游离药物，同时用外透析法进行对比。测得包封率没有明显的差别,但内透析法由于稀释了脂质体,避免了大量脂质体对透析通道的阻塞作用,因此在透析时间上大大较外透析法缩短了。5 大孔树脂法大孔吸附树脂是一种新型不含交换基团且具有大孔结构的有机非离子型高分子聚合物，也叫大网格吸附剂，兼有吸附性和筛选性，是以吸附作用和筛选作用相结合的分离材料。大孔吸附树脂27的多孔性，使其具有巨大的比表面积，能够依靠和被吸附分子之间的范德华力或氢键进行物理吸附；同时，其多孔性还对分子量大小不同的化合物具有筛分作用。可分为非极性（苯乙烯型）、中极性(含酯基)和极性(含酰胺基、腈基、酚羟基等)。目前常用的大孔吸附树脂按其极性大小可分为：非极性树脂(D3520、D4006、D4020、H103、H107、X25 等)； 弱极性树脂(AB-8 等)；极性树脂(NKA2、NKA29、S28等)。而不同型号树脂的比表面积、平均孔径、分离选择性都有所不同，根据实际需要进行选择。用于脂溶性药物脂质体分离时，所选择的大孔树脂应满足能够很好的吸附游离药物且对脂质体几无吸附作用的条件。索绪斌等 28 选择HPD-100大孔树脂分离脂质体和游离药物，实验证明了 HPD-100对黄芪皂苷的吸附能力很好，并考察了HPD-100树脂柱对空白脂质体和黄芪皂苷物理混合溶液的吸附作用，。分离之前对柱子进行了空白脂质体的预饱和，上样后去离子水洗脱脂质体于50ml量瓶，测包封率平均为46.8%；陈志强 29 用D4020 大孔树脂分离脂质体和游离的芝麻素，用空白脂质体预饱和的大孔树脂柱顶端上，上样后用去离子水洗脱直至脂质体全部被洗脱下来，然后用80% 的乙醇洗脱，测得包封率51%55%。芝麻素TLC分析证明D4020 树脂对芝麻素有着很好的吸附能力，预饱和大孔树脂柱对空白脂质体的平均回收率为100.35%，且能很好的保留溶液中及脂质体制剂中的游离药物；陈宝玉30 研究了缓冲盐对不同型号大孔吸附树脂分离脂质体和游离药物能力的影响。结果缓冲盐平衡后的大孔吸附树脂对脂质体的吸附作用均有所降低,且不影响大孔吸附树脂对阿魏酸的吸附能力。其中HPD450对空白脂质体的回收率在97.2%100.8% ,平均回收率为98.1%。但HPD300对空白脂质体的吸附很强烈，分析影响大孔吸附树脂吸附脂质体的因素可能是极性、比表面积、平均孔径、粒度等方面的综合原因。因此,建议实际操作中缓冲盐平衡后的树脂仍用空白脂质体饱和一次,以保证其回收率。对于脂溶性药物脂质体的分离，大孔树脂法并不常用。若选择恰当极性的大孔树脂，对游离药物吸附性能好，而对脂质体无吸附或极少吸附，经过空白磷脂或脂质体的预报和，可以达到较好的分离效果。6滤膜法滤膜法也称过膜法、挤出法，是根据脂溶性药物不溶于水而在水中易形成微粒沉淀的特点，将制备好的药物脂质体挤压通过水系滤膜，脂质体可以通过而游离药物截留在膜上，从而达到游离药物和脂质体分离的目的。滤膜法具有简便、快捷、经济等特点，但并不常用，一般适用于脂溶性药物脂质体的分离。且该法的使用前提是游离药物完全不溶于水，由于各类脂溶性药物的性质差异导致其在水中溶解度也有所不同，使用滤膜法前应进行可行性验证及回收率的考察。李喆等 31 用滤膜法分离脂质体和游离的辅酶Q10前，经精密称取辅酶Q10 原料药和空白脂质体的物理混合液,通过0. 22m滤膜后，测定过滤前辅酶Q10 的量和过滤后辅酶Q10 的量，结果99. 4 %的游离药物被截留。从而确定用此方法将脂质体和游离药物分离；刘荣华32 用0.45m滤膜分离脂质体和游离的齐墩果酸之前，也进行了可行性验证。将2ml原料药和空白脂质体的物理混合液通过水系滤膜，过滤前后样品经HPLC测定，加入的2 ml药物并不能透过滤膜,确定了滤膜法分离齐墩果酸脂质体的可靠性。脂质体制备后，药物以三种形式存在:脂质体中包封的药物;游离的未被包封的药物;溶解在水合介质中的药物。对于脂溶性强的药物,未被包封的游离药物绝大多数均以微晶状态存在,理论上应被0. 22m的微孔滤膜所截留,但在脂质体的制备过程中,不可避免会采用涡旋震荡、机械搅拌或探针超声等步骤,可能使混悬药物的粒径明显减少,从而使之有通过滤膜的可能,因此该法使用前应通过加药测回收率的方法对此进行考察。柯学等 33 采用滤膜法分离脂质体和游离的多西紫杉醇前，考察了该方法的可行性。其三次加样回收率分别为 98.4%、101.2%和 99.0%，确定了滤膜法的可行性。为了减少包封率的测定误差，作者还考察了各种处方比例条件及操作条件下,多西紫杉醇在pH 7. 4磷酸盐溶液中的溶解度，及对包封率测定结果的影响。结果表明,药物在水合介质中的溶解度仅为多西紫杉醇制剂浓度的1%左右，对包封率的影响大约有2%3%。为得到更准确的结果,在计算包封率时仍需将其考虑在内。7 超滤法超滤法有加压超滤和离心超滤两种，方法是将脂质体放入特定的超滤管或滤器中，通过离心或加压的方法，使小分子游离药物滤过下来，而脂质体被截留在膜上，从而达到分离的目的。该法较适用于水溶性药物脂质体的分离，方法简单易行,重现性好,且能达到很好的分离效果。用于分离脂溶性药物脂质体时，与透析法及滤膜法存在相似的问题，即需要考察游离的脂溶性药物在水介质中的溶解性。若游离药物在水介质中呈溶解状态，或制备过程促进了游离药物的溶解，则可以选用超滤法进行分离。否则水中的游离药物易形成较大的纳米粒甚至微晶，不会过滤下来，或阻塞膜孔影响其他小分子的滤过，从而严重影响所测包封率的准确性。雷国峰等34 用加压超滤法分离灯盏花素脂质体和游离药物，分离前分别进行了超滤膜对药物水溶液与空白脂质体的物理混合液和药物水溶液的超滤回收率实验，结果平均回收率分别为96.7%和98.8%。作者由此确定超滤法分离灯盏花素脂质体的可行性，测得了平均包封率为79.2%。值得注意的是，灯盏花素在水中溶解度较低，作者在测定超滤对游离药物回收率实验中，采用NaOH 调pH 值促使灯盏花素溶解来制备药物水溶液，具体的pH 值文章中没有显示。而含药脂质体的水合介质一般在pH 7左右呈中性，此条件下游离灯盏花素的溶解性并不可知。另外，灯盏花素水溶液同空白脂质体物理混合后pH 值也会改变，可能影响脂质体膜的稳定性。因此本文超滤膜对药物水溶液与空白脂质体的物理混合液和药物水溶液的超滤回收率实验有待进一步考察。代文婷等 35 用超滤离心法分离冬凌草甲素脂质体和游离药物。分离前进行不同截留相对分子量的冬凌草甲素透过率实验，精密量取20gmL - 1的冬凌草甲素溶液各4 mL置离心超滤管内管中,分别利用截留相对分子量为5, 10, 30 K的超滤管进行超滤, 3000 rmin- 1离心30 min,超滤液经0.22 m 滤膜过滤后取20L进样,采用HPLC测定含量，透过率分别为98.5% , 98.6% , 98.4%; RSD分别为0.81% , 0.71% , 0.72% ( n = 5) 。结果显示不同截留相对分子量的超滤管对冬凌草甲素的透过率没有明显的差异，最终选择截留相对分子量为10 K的超滤管进行冬凌草甲素包封率的考察。然后，作者还进行了不同浓度冬凌草甲素膜透过率实验，结果低、中、高3 种浓度的平均透过率分别为98.7% , 98.6% , 98,6%; RSD 分别为0.72%,0.67% , 0.46% ( n = 5) 。结果表明冬凌草甲素的浓度对其膜透过率无影响。另外测得超滤加样回收率良好，表明冬凌草甲素与冬凌草甲素纳米脂质载体不发生吸附作用,其对包封率测定基本没影响,超滤离心法符合要求。8萃取法萃取法是利用有机溶剂对脂溶性药物的溶解性而对脂质体无溶解作用通过分层将游离药物和脂质体分离的方法。该法使用必须满足的条件：游离药物在所选的有机溶剂中有良好的溶解性，有机溶剂与水不互溶且对脂质体无破坏作用。刘让如 36 采用萃取离心法分离乳香挥发油脂质体和游离药物，作者首先考察了石油醚和乙醚两种有机溶剂的萃取情况，结果显示乙醚对脂质体有破乳作用,而石油醚则不会溶解脂质体,故选定石油醚为萃取溶剂。分离脂分离前还进行了乳香挥发油的回收率、乳香挥发油在空白脂质体中的回收率以及乳香挥发油脂质体在石油醚中的回收率，平均回收率分别为：98.6%、99.7%、99.4%。作者还对萃取次数进行了考察，结果表明萃取三次，游离药物和脂质体完全分离。张冲 37 采用萃取法分离脂质体和游离的脂溶性营养素。取适量纳米脂质体置10 mL 刻度试管中，分别加入5 mL 正戊烷，漩涡混合3 min，2000 r/min 离心5 min，取上层正戊烷液，重复操作一次，合并正戊烷液，氮气吹干后用乙醇定容至10 mL，用紫外-可见分光光度计或高效液相色谱法测游离营养素含量。萃取法简便易行，成本低且对仪器要求不高，尤其适合脂溶性药物脂质体的分离。但为避免脂质体受到破坏，分离前应进行脂质体在萃取液中的回收率，鉴定方法的可行性。9 鱼精蛋白凝集法 鱼精蛋白的分子量一般在10000左右。其氨基酸组成上的最大特点就是碱性氨基酸占有较大比例, 因此其碱性很强, 等电点为10一12, 可溶于水和稀酸, 热稳定性较好38。鱼精蛋白与带负电或中性的脂质体产生絮凝作用增加了脂质体的密度，从而通过离心即可将脂质体和游离药物分离的方法。该分离法简单易行、可以降低离心转速，其局限性是由于碱性氨基酸的存在, 因此对于负电荷大分子制备的脂质体和负电荷磷脂构成的脂质体，此法不适合。基本程序3：将0.1ml脂质体样品（磷脂20mg/ml）加入到10ml离心管中，加入0.1ml鱼精蛋白溶液（10mg/ml），混合，静止3min。加入缓冲液，离心沉淀脂质体，上清用于测定游离药物含量，沉淀经破乳后测定包裹药物。丁燕飞39采用鱼精蛋白沉淀槲皮素脂质体，经10000r/min离心5min，取上清测游离药物含量来计算包封率。结果显示采用鱼精蛋白沉淀法可降低游离药物与脂质体的分离速度，避免了超速离心对脂质体的破坏。姜素芳等40 采用鱼精蛋白凝集法分离丹皮酚脂质体（平均粒径149.7nm）和游离药物。作者实验中发现鱼精蛋白用量、离心速度和离心时间对包封率的测定有较大影响,结果以加入0.1 mL鱼精蛋白溶液(10 mgL - 1 ) ,2500 rmin 离心15 min 条件为最佳,在此条件下既不会破坏脂质体引起泄漏,又能使脂质体沉淀完全,而且游离药物完全不被吸附从而与脂质体完全分离。以上研究使用鱼精蛋白凝集法并未行方法学考察，而对于脂溶性药物脂质体，混悬液中游离药物若形成微晶，也可能因离心沉淀下来，导致测得的包封率偏高。因此考察游离药物在缓冲介质中的溶解度并且进行游离药物回收率的测定十分必要。孙维彤等41 在用鲑鱼精蛋白凝集脂质体和纳米脂质体的研究中，分别采用Sephadex G-50凝胶过滤法和鱼精蛋白凝集法分离托氟啶脂质体与游离药物，并测定了两种方法对游离托氟啶的回收率，平均回收率分别为71%和100.4%。该结果显示应用葡聚糖凝胶G- 50 柱色谱法, 托氟啶回收率较低,鱼精蛋白凝聚法回收率良好。对于不同粒径的脂质体, 通过调节鱼精蛋白用量可较准确的测定脂溶性药物脂质体的包封率, 它适合小分子药物及正电荷大分子药物脂质体的分离。但值得注意，两种回收率测定方法中，游离药物分别采用50%乙腈和乙醚所配置，而脂质体混悬液一般为磷酸缓冲液，药物所处环境有差别，故其回收率是否受影响还有待进一步考察。结 语脂质体包封率测定方法很多，常用的有离心法、葡聚糖凝胶柱层析法、微型柱离心法、透析法、大孔树脂法、滤膜法、超滤法、萃取法及鱼精蛋白凝集法等。这些方法很好的用于水溶性药物脂质体包封率的测定。但对于脂溶性药物，因其药物的理化性质不同，所涉及到的溶剂千差万别，不是每一种方法都适合所有的脂质体, 故在考察脂质体的包封率时, 只有经试验选择合适的测定方法,进行可行性分析，才能尽量减小测定结果的误差。另外，为了测得较准确的包封率，对要测定的药物的理化性质深入探究也十分必要。参考文献1 M. 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