细胞生物学翻译.doc

通过细胞间的附着作用调节细胞内的PHS.I. Galkina G.F. Sudina， G.B. Dergacheva ， L.B. MargolisA. N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology of Moscow State University, Moscow 119899, Russian FederationLaboratory of Theoretical and Physical Biology, NICHD, NIH, Bethesda. MD 20892,USAReceived 4 August 1995摘要 正如我们之前所叙述的工作，人工培养的纤维母细胞内的PH取决于细胞的安度。在单细胞里pH低，而在多细胞里较高，在一个稀疏的单层细胞中形成细小的和极大的群落。在另一方面，在单层与单层的交界区域中pH低。现在的工作中，我们展示的是在信号转导途径中各种PH控制机制的抑制剂和关键酶抑制因子的影响取决于局部细胞的密度。我们发现细胞间的相互作用诱导那被认为是V-type ATP酶的N-ethylmaleimide 和 7-chloro-4-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazole抑制pHi的升高;同时抑制H传导路径的Cd离子引起单层交界处pH的升高。我们的数据也显示在细胞间相互作用调节pH中逆向转导并没有起到本质上的作用。磷脂酶(4-bromophenacyl-bromide)，磷脂酶C和蛋白激酶C (H-7)的抑制剂改变局部细胞密度调节pH i的方法。这说明细胞间的相互作用是在磷脂酶A2的完全控制和蛋白激酶C的负控制下通过pHi的调整来调节细胞的活动。关键词：细胞内pH；细胞间相互作用；磷脂酶A2；蛋白质酶C；H-ATP酶；Na/H逆向转导；H-电导1. 引言许多细胞的功能都是通过细胞间的相互接触。在细胞里局部环境里细胞数量和细胞行为的影响的机制知识是有待阐明的。之前我们已经说到人工培养的纤维母细胞和其附着的中性粒白细胞中的pHi是依靠细胞与其邻近细胞的相互附着作用和假设通过pHi的调整细胞间的相互作用可以影响细胞质中各种生物化学反应。细胞内的pH的改变是从细胞表面附着受体到细胞内部的信号转导路径所引起的。我们最近的工作是检查关键酶的介入信号转导，如磷脂酶C，磷脂酶和蛋白激酶C通过细胞间的作用来调节pH。这些工作的目的也是为了阐明已知的pHi调节机制有助于通过细胞单元接触来调整pH。2. 材料和研究方法2.1材料牛小腿血清，乳白蛋白水解液和从Institute of Poliomyelitis (Moscow)获得的伊格尔培养基。游离碳酸氢根离子Hanks溶液，N-乙马来酰亚胺，阿米洛利，phorbol-12- myristate-13-acetate (PMA), l-(5-isoquinolinylsulfonyl)-2-methyl- piperazine (H-7)，bafilomycin , CI-NBD, 4-bromophenacyl bromide,新霉素，从Sigma购买的尼日利亚菌素。对于Acetomethyl ether of 2,7-bis(2carboxyethyl)-5,(6)-carboxyfluorescein (BCECF)的pH测量是从Molecular Probes获得。2.2.细胞培养人的纤维母细胞是生长在包含45%伊格尔培养基，45%乳白蛋白水解液和10%牛小腿血清的中间物中。为了获得一个融合单层，细胞被放置在高密度（10cells/ml）中，然后培养4-5天直至融合。然后培养基是“受伤的”：一部分单层被机械移除各培养基要被另外培养2-3天。在这段时间里细胞已从单层的边缘移动到下层的自由区域和形成各种细胞密度的区域：（i）单细胞没有相互接触；（ii）多数细胞，与邻近的几个细胞相互接触；（iii）细胞在伤口的边缘形成一个松散的单层；（iv）细胞在融合的单层中。在测量pHi一个小时前，将介质改为用10mM HEPES(pH7.30)缓冲的游离碳酸氢盐Hanks溶液和测量pH。根据其特殊作用按各种药物的最佳浓度进行加入。在装有DMSO的培养基中加入阿米洛利（10/M）10min或1h,控制培养有细胞的Hanks溶液中加入DMSO溶液相应的数量。为了影响HATP酶细胞，将其放到含有100/M， C1-NBD, 100/M ，NEM 和1/M巴弗洛霉素的Hanks溶液中培养20min。为了影响PLA2，细胞放在含有20 4-bromophenacyl bromide的Hanks溶液中培养20min。为了调节PKC细胞的活动，将细胞放在含有100/IM H-7或 100 nM PMA的Hanks溶液中培养20min。为了影响PLC，将细胞放在含有100新霉素的Hanks溶液中培养20min或1h。为了影响细胞的离子状态，将培养基放在含有10 mM HEPES，108 mM KCI, 1 mM MgSO4, 1 mM CaC1, 0.09%葡萄糖的游离钠介质中培养30min，或放在含有100 Cd离子Hanks溶液中培养20min或40min,或放在含有游离Ca Dulbecco介质中培养10min。2.3.pH测量用装有蔡司透镜显微镜的显微荧光计在5中所描述的两种发射波长（430nm和490nm）下测量用在5M BCECF和在520nm发射光下培养30min的细胞。正如6中所描述的进行校准。所有数据显示的是pHS.E的平均值。获得了1530个细胞各个区域的pH的测量数据。3. 结果与讨论我们发现以前和目前的工作证实，在体外培养的人纤维母细胞pH是取决于局部细胞的密度1-4。使用“受伤的”纤维母细胞单层的技术，我们在正如第二部分所描述的培养基中获得四个不同局部细胞密度的区域。通过比较相同准备的这些区域的pH，我们避免了释放的各种扩散因子对pH的可能的影响（除非它们在一些细胞直径的范围内扩散）。我们发现细胞间的接触的建立导致pH的增加。单细胞中pH低，细胞在形成一个小群落时较高，最大的是在稀疏的单层中。pH再次变低在融合的单层中。细胞内通过细胞密度调节pH的机制是什么？若要评估不同的 pH-controlling 系统的局部细胞密度函数的相对贡献，我们已经测量控制和使用的各种 pH-controlling 途径抑制剂的药物处理过的培养基在这些区域的细胞内 ph 值。激活的那起 Na+/ H + 逆向转运显示要增加细胞内 ph 值的主要机制的可溶性生长因子和分裂素的刺激（7 审查）。我们测量在Na/ H 逆向转运抑制剂（阿米洛利）存在下不同细胞密度区域的pH。在有10M阿米洛利的培养基中培养10min后，在细胞单层边缘的区域中pH增加，在小群落细胞中增加程度较小（表1）。虽然药品仍然存在于介质当中，在1h的培养后阿米洛利的作用相反和pH降低至控制标准。K取代细胞外的Na+对不同细胞密度的区域的pH不产生影响，但在融合单层中有所增加。这些结果表明即使它的活动可能有助于pH的减少根据在融合单层中许多细胞接触的建立，但Na/K抑制剂并不是pH依靠细胞密度的原因。我们已经检测过是否是H-ATP酶的抑制影响pH调节的细胞密度依赖性。等离子局部膜H+-pH酶被发现在生理的pH水平中是有效的和有助于保持附着的固定在那的巨噬细胞8,9和破骨细胞10的pH稳定的水平。我们使用H+-ATP酶抑制剂11Cl-NBD,NEM和巴弗洛霉素（在后边的报告是一种有液泡形的H+-ATP酶的特殊的抑制剂。）处理培养基。我们发现NEM和NBD（100M，10min）显著减少pH（表1）,以致pH几乎在细胞所有的区域中都相同。巴弗洛霉素（1M，10min），证明在我们的实验中人工抑制细胞质酸化碱化12,13是无效的（表1）。早些报道称，这对于附着的巨噬细胞9的pH并没有影响。无论是在这些细胞H+-ATP酶对抗巴弗洛霉素，或是NEM和Cl-NBD有一些其它的机制有待进一步研究。图2 新霉素对各种细胞密度区域中纤维母细胞pH的影响 *P 0.05; *P 0.01; *P 0.001,图1 4-bromophenacyl bromide对各种细胞密度区域中纤维母细胞pH的影响 *P 0.05; *P 0.01; *P 0.001,图3 H-7对各种细胞密度区域中纤维母细胞pH的影响 *P 0.05; *P 0.01; *P 0.001在估计在细胞内pH的调节H在细胞接触传导途径中的作用，我们研究了Cd离子在不同细胞密度的区域中的pH。为了增加在融合单层中的pH在含有100M Cd的细胞培养基中培养20min。因此H+导率在局部高密度的细胞区域中不起维持高水平pH的作用，但有助于减少融合单层中的pH，这可作为一个质子流入机制的例子来解释。虽然开放的H通道可能导致向内和向外的电流14，15，但只有向外的H流被发现在广泛的范围内防止细胞质的过度酸化14-19。Ca在调节pH上起着重要的作用：Cd进入被称为：“模仿蜗质子流动的效应”在蜗牛神经细胞中15,20。在我们实验中，在任何细胞密度区域中游离Cd介质不影响pH，但pH相对于控制有所上升在密集的单层中（表1）。游离Ca对pH的影响与Cd相似，可能引起的机制也是相同的，因为Cd被报告说去堵塞Ca2+通道的，因此阻碍了Ca的进入。我们通过在各种细胞密度区域中研究磷脂酶C，磷脂酶A2和蛋白激酶C的pH来查找细胞间接触中信号转导在调节pH上起作用的关键因素。PLA2 4-bromophenacyl bromide（20M，20min）抑制剂在所有细胞密度的区域中降低pH除了在单细胞中（图1），因此使pH变成对细胞密度不依赖。PLC，新霉素 (100M，20min)抑制剂在所有细胞密度区域中增加pH，而没有在融合单层中降低pH（图2）。细胞中所有密度区域的pH增加在含有PKC H-7(100M，20min)抑制剂的细胞培养基中培养。在局部高密度区域中影响是取显著的，特别是在融合单层中（图3）。在H-7处理后，pH随着细胞密度的增加而增加。用PMA（20min,100nM）激活的PKC对上述的PKC抑制剂有相反的作用：pH在单细胞中增加，而在单层中降低。因此pH与细胞密度呈负相关（图3）。它似乎是由细胞粘附受体与相邻细胞接触诱导占领PLA2的活性，从而导致pH的增加。细胞间接触也刺激PLC和PKC来执行pH的负调控。总之，我们发现抑制各种细胞酶的药物对pH的影响是依靠细胞密度的。一个在与信号转导有关的酶之间复杂的相互作用似乎取决于细胞密度，pH调节依赖于细胞间接触的数量。pH的变化影响细胞内的化学反应来对邻近细胞的功能进行控制。参考文献：1 Galkina, S.I., Sudina, G.F. and Margolis, L.B. (1992) Exp. Cell Res. 200, 211-214. 2 Galkina, S.I., Sudina, G.F. and Margolis, L.B. (1992) Biol. Membr. 5,925-935. 3 Galkina, S.I., Sudina, G.F. and Margolis, L.B. (1994) Biol. Membr. 7, 17-26. 4 Sudina, G.F., Galkina, S.I., Barski, O.A. and Margolis, L.B. (1994) FEBS Lett. 336, 201-204. 5 Paradiso, A.M., Tsien, R.J. and Macheu, T.E. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7436-7440.6 Thomas, J.A, Buchsbaum, R.N., Zimniak, K.A. and Racker, E. (1979) Biochemistry 18, 22102218. 7 Grinstein, S., Rotin, D. and Mason, M.J. (1989) Biochim. Bio- phys. Acta 988, 73-97. 8 Tapper, H. and Sundler, R. (1992) Biochem. J. 281,239-244. 9 Tapper, H. and Sundler, R. (1992) Biochem. J. 281,245-250. 10 Baron, R., Neff, L., Louvard, D. and Courtoy, P.J. (1985) J. Cell Biol. 101,221(2222. 11 Forgac, M. (1989) Physiol. Rev. 69, 765 796. 12 Nanda, A., Gukovskaya, A., Tseng, J. and Grinstein, S. (1992) J. Biol. Chem. 267, 22740-22746. 13 Swallow, S.J., Grinstein, S., Sudsbury, R.A. and Rotstein, O.D. (1993) 158, 453460.14 DeCoursey, T.E. and Cherny, V.V. (1994) J. Membr. Biol. 141, 203 223. 15 Thomas, R.S. (1989) Ann. NY Acad. Sci. 574, 287-293. 16 Henderson, L.M., Ch