A基因克隆的技术要点.ppt

T A基因克隆的技术要点 08应生狄天元 主要内容 一 重组T质粒的构建 二 重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定1 大肠杆菌感受态细胞的制备2 重组DNA的转化3 重组质粒的鉴定 T A克隆 T A克隆方法 OriginalTACloningKit 是把5 A突出的PCR片断与一个具有3 T突出的载体DNA连接起来的方法 PCR反应中所适用的聚合酶具有末端转移的活性 通常在5 加上A 只有用经过特殊处理的具有3 T突出末端的DNA片断才能通过T A配对进行连接 比平头连接效率高50 100倍 3 A突出的PCR产物 使用不同的Taq酶 在PCR扩增循环结束后 加上72 10分钟一个过程 Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A 使用高保真的DNA聚合酶 如pfu酶 其不能在扩增产物的3末端加上A 得到的DNA序列为钝端 因此 在回收纯化后进行加A的过程 通常是以PCR回收产物为模板 加上一定量的普通Taq酶和反应液 加入dATP 或dNTP 72 10分钟 T载体 一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头 再在70 或72 下在只加入dTTP的反应体系中用TaqDNA聚合酶处理半小时 也有人报道处理1 2小时能提高克隆效率 这样加T反应会更彻底 也可以用末端转移酶来完成加T反应 载体自连 PCR产物串连可以忽略 如果使用ddTTP 效果会更好 T载体 pMD18 TVector是一种高效克隆PCR产物 TACloning 的专用载体 它由pUC18载体改建而成 在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点 用EcoRV进行酶切反应后 再在两侧的3 端添加 T 而成 pUCm T由pUC 19改建而成 pUC18载体 pMD18 TVector pUCm T pUCm T的多克隆位点 PCR克隆目的基因的基本程序 大肠杆菌感受态细胞的制备 原理受体细胞经过一些特殊方法 如CaCl2等化学试剂法 的处理后 细胞膜的通透性发生变化 成为能容许许多外源DNA的载体分子通过的感受态细胞 competentcell 大肠杆菌感受态细胞的制备 操作方法1 取1支无菌的摇菌试管 在超净工作台中加入2mLLB 不含抗生素 培养基 2 从超低温冰柜中取出DH5 菌种 取2 L菌液接入含2mLLB培养基的试管中 37 C摇床培养过夜 3 次日取0 5mL上述菌液转接到含有50mLLB培养基的三角烧瓶中 37 C下250r min摇床培养2 3h 测定A590为0 375 0 4 细胞数 108 mL 此为关键参数 以下操作除离心外 都在超净工作台中进行 4 将菌液分装到1 5mL预冷无菌的Ep管中 于冰上放置10min 然后于4 C下5000r min离心10min 大肠杆菌感受态细胞的制备 操作方法5 将离心管倒置以倒尽上清液 加入1mL冰冷的0 1mol LCaCl2溶液 立即在快速混匀器上混匀 插入冰中放置30min 6 4 C下5000r min离心10min 弃上清液后 用1mL冰冷的0 1mol LCaCl2溶液重悬 插入冰中放置30min 7 4 C下5000r min离心10min 弃上清液后 用200 L冰冷的0 1mol LCaCl2溶液重悬菌液 超净工作台中按每管100 L分装到1 5mL离心管中 可以直接用做转化实验 或立即放入 80 C超低温冰柜中保藏 可存放数月 8 在被细菌污染的桌面上喷洒70 乙醇 擦干桌面 外源DNA的重组与转化 DNA的体外连接重组其本质是一个酶促反应过程 即在一定的条件下 DNA连接酶催化两个双链DNA片段的5 端磷酸和3 端羟基之间相互作用 形成磷酸二酯键的过程 DNA连接酶有两种 T4噬菌体DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶 其中T4DNA连接酶对作用底物要求低 能更有效地连接DNA的平末端 应用更为广泛 外源DNA的重组与转化 T4DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步 首先 T4DNA连接酶与辅因子ATP通过T4DNA连接酶中亮氨酸的氨基与ATP中的磷酸作用形成酶 ATP复合物 然后 酶 ATP复合物活化DNA的5 端的磷酸集团 通过磷酸 磷酸键结合到DNA分子上 使DNA腺苷酸化 最后 DNA链3 端的羟基活化 取代ATP后与DNA链5 端的磷酸根形成磷酸二酯键 释放出AMP 完成DNA的连接 外源DNA的重组与转化 转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程 原理细菌处于0 C时 CaCl2低渗溶液中 菌细胞膨胀成球形 转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基 钙磷酸复合物黏附于细胞表面 经42 C短时间热击处理 促进细胞吸收DNA复合物 将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间 促使在转化过程中获得新的表型 如Amp 等 得到表达 然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上进行培养获得阳性克隆 外源DNA的重组与转化 重组 连接 1 取1支无菌Ep管 用微量进样器按下表顺序加入各成分 表1连接反应体系 外源DNA的重组与转化 重组 连接 2 盖好盖子 用手指轻弹Ep管数次 并于台式离心机离心2s以集中溶液 3 将反应管于16 C的条件下 连接过夜 12 16h 外源DNA的重组与转化 转化 第二天上午进行 取200 L摇匀的感受态细胞悬液 如果是冷冻保存液 则需解冻后立即使用 加入10 L连接产物 轻轻摇匀 勿吹打 冰上放置30min 于42 C温育2min后 迅速冰浴冷却3min 加入300 L的预热LB液体培养基 SOC培养基 使总体积约为0 5mL 该溶液称为转化反应原液 摇匀后于37 C 100r min摇床培养60min 3000r min离心4min后去上清 用枪头轻吹管底悬浮沉淀 接种于汗抗生素的LB平板培养基上 涂匀 静置15min 待菌液被培养基吸收 倒置平板 37 C培养12 16h 观察菌落生长情况 待菌落生长良好而又未互相重叠时 停止培养 重组质粒的鉴定 蓝白斑筛选法 由pUC18载体构建的pMD18 TVector含有复制起点 ori 青霉素抗性基因 Amp 以及lacZ的启动子及编码 肽链的DNA序列 并且在lacZ基因中有一段多克隆位点 MCS 区段 当外源的DNA片段插入到这些克隆位点时 使 互补链破坏形成的是无活性的 半乳糖苷酶 于是被转化的大肠杆菌细胞 就在Xgal IPTG培养基上形成白色菌落 而相反没有外源DNA插入的质粒转化大肠杆菌细胞后 在Xgal