利用稳定的缔合络合电喷雾质谱法检测水中三聚氰酸.doc

利用稳定的缔合络合电喷雾质谱法检测水中三聚氰酸氰尿酸可能对人体的肠胃或肝脏有毒，而且对生态系统的长期影响尚未可知。脲氰酸溶于水后离解为氰尿酸盐（图1），氰尿酸盐可通过各种方式进入外界环境：脲氰酸本身非常稳定，被用作游泳池中消毒剂氯气的稳定剂。随着消毒剂的使用次数的增加，氰尿酸在游泳池里的浓度逐渐增高，当游泳池里的水被排出时，氰尿酸就可能随着水的排出而渗透到水源中；氰尿酸也可能作为除草剂西玛津和莠去津的降解产物，经微生物降解、化学氧化、光氧化等进入环境；饮用水经常采用化学或光氧化手段进行净化，所以氰尿酸也可通过水的净化过程进入到饮用水中。考虑到三嗪降解产物的毒性，三嗪被美国环境保护局列入饮用水中有毒物质的清单中，这份清单中的物质有可能被限定含量。除了被微生物修饰或降解，氰尿酸在各种环境中都很稳定，也就是说，在判定的个体降解产物总量不可靠的情况下，它可以作为除草剂分解和空间分布的标记。图 1 三聚氰酸的结构，水中以三聚氰酸盐的形式存在根据最近发表的综述的资料：目前有的几种测定氰尿酸的方法中，比较权威的是采用液相色谱仪进行测定，对这一技术的改进最近已有不少报道。高性能液体色谱，由相对保留时间提供的定性方法，该方法用在法律仲裁中不能提供足够的定性理由。因此需要有一种相对独立的技术，常用质谱法定性来增加它的可信度。氰尿酸在通过前处理进化程序用固体探测技术质谱分析，或通过衍生化后，采用气相色谱/质谱分析。采用常规液谱质谱分析方法是有缺陷的，因为用于高效液相色谱法检测氰尿酸时，常规的洗脱液中包含能迅速降低液质联机性能的不挥发成分。除了难以挥发的成分以为，另一个针对脲氰酸类小分子的检查来说，采用普通电喷雾质谱法检测的制约因素是：它的质量数在电喷雾质谱中，落入化学噪音区域，这个区域包括由样品中包含的或样本在界面形成的小质量离子光谱所形成的干扰。比如在一种氰尿酸检测的方法中，使用易挥发溶剂做流动，利用相高效液相色谱电喷雾质谱法测定，在检测过程中，一种不断流出的未知离子干扰对脲氰酸的检测。经对铬盐、高氯酸盐、卤代乙酸盐、过渡金属、硼等试验证实，在样本中增加一种选择性络合剂可以克服这些化学噪声。因为络合剂可形成一种比被测定物本身质量高的选择性缔合复合体，增加对测定物的定量分析的可信度。本文我们用稳定的缔合络合电喷雾质谱（cESI-MS）对氰尿酸进行测定。因为没有可利用的氰尿酸的公认分析标准方法，实验测定氰尿酸在水中分布时，采用常规高效液相色谱法进行比较。实验实验试剂： 溴化乙基三甲基铵(C6) 2650-53-5，溴化辛基三甲基铵 (C8) 2083-68-3, 溴化葵基三甲基铵 (C10) 2082-84-0, 溴化十二烷基三甲基铵 (C12) 1119-94-4，溴化十四烷基三甲基四乙铵 (C14) 1119-97-7, 溴化十六烷基三甲铵 (C16) 57-09-0, 氯化四乙铵 (Q2) 56-34-8，氯化正四丁基铵(Q4) 1112-67-0 等购于Fluka（Buchs, Switzerland)，有机溶剂购于Fisher (Fairlawn, NJ)优或类似级，氰尿酸（108-80-5）用去离子水超声溶解。实验仪器：注射器用Rheodyne 型7725的圆柱型20uL注射器（Rohnert Park, CA）。液谱采用WATERS 600(Milford, MA)泵，流动相90/10 (v/v)甲醇/水。质谱仪是带有标准电喷雾接口的 Finnigan MAT TSQ-700 (San Jose, CA)，质谱在负模式下扫描Q3相应区域得到，其他实验参数列于表1 。高效液相色谱仪操作条件如前所述简言之，Bioanalytical Systems (W.Lafayette, IN)高效液相色谱，Rheodyne 7125型的20L注射器，单通道紫外吸收率检测器。色谱柱APGC（10cm0.30cm），Phenomenex (Torrance,CA), 柱温35 C，流动相流速0.8mL/min，含50mM的磷酸氢二钾（PH9.1）。表一 稳定缔合络合物三聚氰酸的质谱（cESI-MS）测定采集参数采集模式负电喷雾质谱仪离子检测m/z 361,408采集速率 0.2HZ离子源喷雾势-0.4KV接口毛细管温度250护套气压70psi（480Kpa) 注射方式/注射量液体注射/10uL载液 90/10（V/V）甲醇/水载体流动速度0.3ml/min提取条件水溶液提取比例/萃取溶剂 3：1甲基叔丁基醚：水重组体积/溶剂 0.100ml含水的C10萃取浓缩比例（表面上） 10：1细节特性检测极限0.2mg/L定量分析时间5min实验过程： 通过预备实验优化CESI-MS质谱仪操作条件，用大量的水溶性氰尿酸直接与季铵盐表面活性溶液混合。水样采取下面提到的方法进化，测量体积及浓度见表1中。通过大量预备实验，得到优化条件如下：1ml的水样一次性加入4ml具塞聚四氟乙烯小瓶中，用0.075毫升浓度为0.25%(W/W)的硫酸酸化, 再加入3.0毫升的有机溶剂，塞好瓶塞用力摇晃2分钟，然后定量取出2.5ml有机相，将有机溶剂用氩慢慢的蒸干，然后用0.1毫升的季铵盐表面活性剂重新稀释，取10ul样品注入到ESI-MS。表二 季铵盐表面活性剂对三聚氰酸络合物表面活性剂的峰面积变化的影响：Quaternary ammoniumsurfactanta Relative peak areab（季铵盐表面活性剂） （相对峰面积）Q2(四乙基) not detectedc ( 没有检测出)Q4（四丁基） not detectedc (没有检测出)Q6（已基三甲基） 7.50.7Q8（辛基代三甲基） 7.50.3Q10（葵基三甲基） 16.60.3Q12（十二烷基三甲基） 11.10.2Q14（十四烷基三甲基） 5.20.2Q16（十六烷基三甲基） 4.90.5a所有表面活性剂是0.01M，三聚氰酸浓度为100mg/L. b显示为xn-1 ,其中n=3 c 用Q2或Q4的话，在质量上没有适合三聚氰酸络合物的检测.结果与讨论 提取工艺的影响 用窗体顶端从水中提取三聚氰酸的效率：使用二氯甲烷，正己烷，甲苯，乙酸乙酯和甲基叔丁基醚（ MTBE ）为溶剂进行提取，根据cESI-MS检测结果，乙酸乙酯和MTBE效率较高。其他溶剂中的提取液窗体顶端没有检测到三聚氰酸。甲基叔丁基醚被选为提取用溶剂，因为它的挥发性强，有利于制备样品的溶剂快速蒸发。氰尿酸的电离常数是6.9，所以样品要用硫酸中和，PH至PH6, 在PH36之间萃取的结果稳定。氰尿酸在水/辛醇的分配系数大约是-0.2, 说明脲氰酸在甲基叔丁基醚或乙酸乙酯的相容性较差。因此采用大量的甲基叔丁基醚以便一次就将足量的氰尿酸萃取到有机相。络合剂的影响使用cESI-MS分析通过电喷雾质谱测定氰尿酸稳定缔合络合物，通常可在质谱中观测到分析样品的杂质或界面形成干扰，这个现象通过建设性的使用合适的络合剂，如铬盐，高氯酸盐、高氯酸盐等的定量分析中获得很好的解决。选择季铵盐表面活性剂进行质谱法研究，是因为氰尿酸（及盐）和季铵盐表面活性剂之间有较好的的络合性能，HPLC试验可使用季铵盐表面活性剂作为离子对试剂。根据类似的方法，在水相中，利用该方法分析卤代醋酸盐及高氯酸盐的分析获得成功。 图2，浓度为100mg/L的三聚氰酸溶液的C10络合剂的面积，方差线代表n-1其中n=3.图3， 50mg/L的标准三聚氰酸.溶液的三个连续注射液，m/z=408对应着C10 +Br + CYA络合物。这个插入显示了络合物的质谱的全扫描。 表2总结了各种季铵性盐作为络合剂的试验结果。四烷基季铵盐（Q2和Q4）络合剂没有被质谱检测到。三甲基烷基季铵盐（Cx)将氰尿酸转换成氰尿酸盐（CYA)，在负模式下将氰尿酸络合为Cx +CYA+Br 和Cx +CYA +CYA。同时还可发现带正电的络合形式，Cx + Cx + Br，这一现象曾经在一个另一研究中被报道32。此次实验未采用正离子模式，因为它的灵敏度低。在正离子模式下往往具有较高的本底，尤其是在低的m/z下限制了仪器的灵敏度。Cx + CYA + Br系列离子质谱峰度最强，可以观察到系列Cx质谱峰，其中碳10络合物产生最强的质谱峰度。 信号强度（表2）与络合物的形成/电离效率和在传输过程中通过电接口进入质量分析仪的稳定性有关。完整的研究络合物的稳定性及信号强度超出了本文的范围，但是观察表2中质谱信号强度对研究各种表面活性剂得络合是很有意义的。络合物电离/形成的效率与电喷射将液滴由液相离子转换为气相的能力有关。令人惊讶的是，在表2中C8和C10之间的峰面差是C10和C12之间的两倍， C6与C8之间的变化相比较小。C10与C12之间的差别可能是因为质量数大的离子的运输减少的原因，一个类似的改变应该发生在C8与C10之间，但这种情况没有发生。没有产生这种现象的原因可能是疏水作用增加了C10络合物相对于C8络合物的强度和稳定性，尽管单一疏水作用不能使得离子强度增加一倍。另外一个解释可能与一个有趣的研究结果相关，报告中指出C10在表面张力上表现出时间依赖性，然而C8却不能。C8的表面张力在气液表面发生变化时，可迅速达到最大值，然而，C10的表面张力在气液表面发生变化时需要一段时间才能达到最大值。因此，在液滴刚形成的时候，含有C10的液滴相对于C8可以获得一个较低的表面张力，导致液滴更大程度的裂变和离子络合物数量的最终传输。按照这种解释，同C10一样，C12在表面活性张力上也应该显示相似的时间依赖性。但同类型的结果，却没有在C10与C12之间得到。尽管关于表面张力的时间依赖性的研究尚未在高电压电喷射的条件进行研究；它依然可能是一个有趣的原因。 图2显示了C10+CYA +Br络合物浓度与峰面积的变化情况，其中氰尿酸浓度100mg/L (0.78 mM)是固定不变的。图2的变化源于两个因素，随着浓度的C10浓度的升高，化学络合增加，同时过量电荷抑制了电喷射效率。降低C10的浓度到1mM时，它的峰面积在达到最大，可能因为在较低电离强度下电喷射效率增加。同时，络合物形成的总量受C10和氰尿酸之间摩尔比率的影响，在最低试验浓度限0.5mM，C10成为形成络合物的关键原因，影响着峰面积的变化。因此，从实际的角度看，根据图二给出的结果，为了避免氰尿酸的浓度影响络合物的数量，C10的摩尔浓度应当是氰尿酸的10倍，在这个研究中，采用脲氰酸浓缩为10mM对应的C10样品被用作测定样品。表三（cESI-MS）法的标准曲线与HLPC法比较 标准加入 线性相 线性相关 (CESI-MS)量的曲线 关系数 系数浓度 浓度与HPCL样品 相对斜率 （CESI-MS） 相比较（%）DI 3.600.01 0.999996 00.066 1 2.980.01 0.999979 20.60.1 8812 2.810.01 0.999999 5.870.02 11733 3.600.07 0.999208 221 10054 2.80.2 0.995132 422 10365 2.80.5 0.992516 401 9126 没有检测出 没有检测出7 2.160.08 0.997681 392 8878 4.40.2 0.997048 803 1003尿 10.80.6 0.996626 5.00.4 1065图3是三个标准的50毫克/升氰尿酸进样形成的图谱。在图三的插图中显示了全部质谱扫描的一部分，显示了络合体的质量。每个峰值代表了一次进样的ESI - MS分析结果。样品峰顶部有些扭曲，可能是因为样品水溶液与流动相溶液混合时，形成的漩涡。因为流动相采用90%是甲醇，增加50%甲醇可改进峰形，软件可成功处理峰形的问题，因此没有选择这种方法。 ESI - MS检测范围根据美国联邦法的规定，检测极限（MDL）是对一种重复注入分析物的分析精度的评价。cESI-MS对氰尿酸测定在优化条件下的检测极限是从七次重复注入低浓度的3.14n-1 算出的。对于1mg/L的溶液，用MDL法推算出是0.13mg/L。有意思的是，与MDL法相比，检测极限的估计值即： 040mg/L的三聚氰酸的标准溶液所做的标准的曲线标准偏差的3倍是0.2mg/L,计算结果与检测所得的MDL几乎相同，说明该方法的检测受限在0.10.2mg/L之间。检测浓度极限是基于1ml的三聚氰酸的水溶液转移到0.100毫升表面活性剂水溶液中，该检测范围应该是实验室内研究已知浓度的三嗪类除草剂的降解所选择的浓度712，可以通过大量的研究来获得更低的检测范围。图2首先说明可以通过更低浓度的C10获得更好的电喷射效率，如前所述此次试验C10依然过量。第二，检测范围可以通过取用更大体积的水量来降的更低。在这个研究中，选择 1.0.mL是为了方便使用一次性萃取容器。第三，提取物的重新定溶浓度可以更低，0.100mL是适合容器的选择。第四，另外一种降低检测范围的途径是用固相萃取法(PGC)。由于三聚氰酸和色谱柱的独特的相互作用，250毫升水样提取和定容后不少于0.5毫升。这些样品处理/预浓缩的方法该实验中无一采纳，因为检测范围证明cESI-MS比传统的高效液相色谱分析对游泳池的水中三聚氰酸的检测灵敏度高：液相色谱的检查浓度是10100mg/L是cESI-MS检测极限的50500倍。实际样本中的三聚氰酸测定的准确度从八个水池里收集的水分别用cESI-MS和常规高效液相色谱法两种技术进行分析，结果见表3。表三显示标准添加法得出的的斜率相互之间都不同，而且与蒸馏水也不相同。这可能是由于许多杂质与三聚氰酸一起从水样中萃取出来，这些物质可能使电喷射效率发生改变。标准添加技术可以考虑这些因素，正如利用高效液相色谱法检测所获得的高相关系数和回收率。 按照标准添加法对cESI-MS进行准确率测定，用水重新溶解提取的乙干燥的三聚氰酸，可确保三聚氰酸和C10溶解。然而, cESI-MS对其他分析物测定时使用有机溶剂溶解，出现两个值得关注的变化：第一是由于水在界面区的积累造成的质谱强度的漂移，因为总能在接口底部观察到一个小小的水滴。水聚集在界面区，可诱导在界面的毛细管表面产生温度梯度，从而对样品产生脱溶作用。幸运的是，根据所有离子强度漂移的的比例是相同的这一假设，可以选取复合物的一个离子来校正。在这个研究中，选C10 +Br+Br-复合物作为标准，利用361m/z离子达到应有的敏感度。第二个影响是试样在注射三到四遍后，复合物的信号才会稳定。可能是由于直到萃取的混合物累